Преэклампсия (ПЭ) по-прежнему остается тяжелым осложнением беременности и частой причиной материнской и перинатальной смертности. В настоящее время не существует единого специфического маркера для диагностирования ПЭ, используются различные методы многомерного скрининга, основанные на данных анамнеза, ультразвукового исследования и количественном определении неспецифических маркеров в сыворотке и моче [1, 2].
Одним из факторов, приводящих к развитию ПЭ, может быть чрезмерный иммунный ответ матери на беременность, в результате которого наблюдаются нарушение плацентации, ишемия плаценты и, как следствие, повышенная гибель клеток трофобласта [3]. Плацента является связующим звеном между матерью и плодом, выполняющим транспортную, эндокринную и барьерную функции. Кроме этого, плацента с помощью молекул человеческого лейкоцитарного антигена (HLA-G) подавляет чрезмерные иммунные реакции материнского организма, вызванные тканями трофобласта и полуаллогенного плода [4]. Снижение иммунологической толерантности и экспрессии молекул HLA-G приводит к активации T-лимфоцитов и повреждению плацентарного барьера.
В поддержании целости плацентарного барьера участвуют молекулы клеточной адгезии (МКА), в том числе Е-кадгерин (E-cad) [5]. Данные молекулы клеточной адгезии являются важной связующей частью адгезивных контактов, формирующих цитоскелет клетки, а также обеспечивающих структурную целостность тканей. При агрегации и слипании клеток между собой происходит уменьшение межклеточной проницаемости и степени миграции веществ и молекул через ткани. Благодаря межклеточной адгезии через плаценту могут проникать только определенные молекулы и белки. E-cad является кальций-зависимой молекулой, опосредующей клеточную адгезию при участии ионов кальция [6]. E-cad существует в двух формах: мембраносвязанной и растворимой. Мембраносвязанный E-cad представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 120 кДа и состоит из внеклеточной, трансмембранной и внутриклеточной областей; N-конец внеклеточной области взаимодействует с N-концом E-cad другой клетки, формируя межклеточную связь E-cad–E-cad, которая позволяет клеткам трофобласта сохранять целостность плацентарного барьера. Нарушение межклеточных контактов, сформированных молекулами Е-cad, влияет не только на межклеточную адгезию, но также на путь передачи сигналов Wnt и некоторых факторов роста [7, 8]. Разрушение E-cad приводит к увеличению уровня растворимой формы Е-cad (sE-cad) в плазме крови, что является проявлением потери межклеточных адгезивных контактов трофобласта и увеличения проницаемости плацентарного барьера. sE-cad является внеклеточным фрагментом E-cad, имеет молекулярную массу 80 кДа и образуется непосредственно из E-cad при участии матриксной металлопротеиназы (MMPs), молекулы ADAMs. α-секретазы, B. fragilis токсина и протеаз HtrA. sE-cad активирует сигнальные пути EGFR, Wnt/ β-catenin и IGF-1R и ингибирует передачу сигналов Hippo. Изменения в вышеупомянутых путях могут также активировать деятельность ADAMs и MMPs, еще более увеличивая производство sE-cad. Данная молекула выполняет функции, во многом противоположные E-cad. Также sE-cad препятствует образованию новых адгезивных соединений, взаимодействуя с внеклеточным доменом E-cad и блокируя, таким образом, межклеточные контакты.
При нарушении иммунологического баланса и проницаемости плацентарного барьера в кровь попадают антитела, NK-клетки, увеличивается цитотоксическая активность лимфоцитов, что приводит к эндотелиальной дисфункции, системной воспалительной реакции и развитию ПЭ [9].
Целью данного исследования было определить содержание растворимой формы sE-cad в плазме крови и плаценте женщин с ПЭ для оценки его участия в развитии ПЭ.
Материалы и методы
Было проведено исследование «случай-контроль», включающее 55 беременных женщин, которые наблюдались в научно-поликлиническом отделении и были родоразрешены в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Женщины были разделены на 2 группы – основная и контрольная. В основную группу вошли 35 беременных женщин с диагнозом ПЭ. ПЭ диагностировалась как повышение артериального давления (АД) выше 140/90 мм рт.ст., впервые выявленное после 20 недель беременности, сопровождающееся протеинурией (>0,3 г/л). Контрольную группу составили 20 женщин с неосложненной беременностью, без отягощенного акушерского анамнеза, родоразрешенных в срок. Исследование было одобрено локальным Этическим комитетом. Критериями включения в исследование были беременность сроком от 27 до 40 недель, возраст беременных от 18 до 45 лет, отсутствие тяжелой экстрагенитальной патологии. Критериями исключения были резус-конфликт, хронические воспалительные заболевания в фазе обострения, аутоиммунные заболевания, онкологические заболевания, пороки развития плода. Определение содержания sE-cad в плазме крови проводили методом иммуноферментного анализа ELISA с использованием набора Human E-Cadherin ELISA Kit, Cusabio (США). 5 мл материнской периферической крови собирали в пробирки с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) и обрабатывали в течение 1 ч после отбора проб. Образцы крови центрифугировали в 2 этапа при 4◦С: 1-й этап – 10 минут, 200 g; 2-й этап – 10 минут, 4500 g. Образцы хранили при температуре -80◦С до дальнейшей обработки. Ткани плацент собирали посередине между краем и центром каждой плаценты в течение 1 ч после родов и изучали с помощью метода «вестерн-блот». Белки денатурировали, разделяли гель-электрофорезом и переносили на мембрану (PVDF). Затем проводили иммуноокрашивание для визуализации белка на мембране.
Cтатистический анализ
Результаты представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей Me (Q1; Q3) для непараметрической статистики. Статистическая значимость различий определялась с помощью параметрического t-критерия Стьюдента при соблюдении нормального распределения, определенного с помощью критерия Шапиро–Уилка и равенства дисперсий, определенного с помощью критерия Левина. При несоблюдении указанных условий использовался непараметрический критерий Манна–Уитни. Сравнение групп по качественным признакам проводилось с помощью точного критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Для статистической обработки результатов и построения графиков использовались программы Stattech (Россия), Statistica 10 (USA).
Результаты
Основные клинико-анамнестические данные и значимые осложнения беременности женщин представлены в таблице.
Возраст обследованных женщин варьировал от 26 до 45 лет и составил в основной группе 35 (6) и в группе контроля 34 (4) года, что не представляло значимого различия. Не выявлено значимых различий по паритету женщин в группах. Срок беременности на момент родоразрешения был значимо ниже в группе ПЭ (p<0,001) и составил в среднем 35 недель в группе ПЭ и 39 недель – в группе контроля. Анализ антропометрических данных не выявил статистически значимых различий между группами.
В группе ПЭ рождались дети в среднем со значимо меньшей массой тела (2372 (898)) г, чем у женщин с неосложненным течением беременности (3204 (345)) г (p<0,001). В 10 случаях отмечалась задержка роста плода. В 18 случаях в группе ПЭ имело место рождение недоношенных новорожденных.
В группе пациентов с ПЭ наблюдалось повышение уровня sE-cad в периферической крови по сравнению с контрольной группой. Содержание sE-cad в контрольной группе составило 3,87 (2,61; 5,79) нг/мл, у женщин с ПЭ – 8,001 (4,99; 11,85) нг/мл (р<0,001) (рис. 1).
Следующим этапом нашего исследования было определение содержания sE-cad и Е-cad в тканях плацент с помощью вестерн-блота. В результате проведенного эксперимента мы обнаружили, что в группе ПЭ содержание sE-cad было большим (1,13 (0,91; 1,42) отн. ед.) по сравнению с содержанием sE-cad у женщин, чья беременность протекала без осложнений (1 (0,7; 1,15) отн. ед.) (рис. 2, 3).
Экспрессия Е-cad в группе ПЭ (0,98 (0,47; 1,21) отн. ед.) при сравнении с группой контроля (1 (0,7; 1,15) отн. ед.) статистически не различалась.
Обсуждение
Анализ литературы по данной теме показывает, что в разных исследованиях получены противоречивые результаты. В исследовании Blechschmidt K. et al. (2007) с помощью иммуногистохимического окрашивания сравнивали ткани плацент от беременных с ПЭ и неосложненной беременностью. Анализ показал значительное снижение иммунореактивности мембранной формы Е-cad в плацентах, полученных от беременных с ПЭ, что отражает повреждение плацентарного барьера. Недостатком данного исследования является малый объем выборки [10]. Похожее исследование, но с большим объемом выборки было проведено Peksa M. et al. (2022), где обнаружено уменьшение экспрессии E-cad в плацентах беременных с ПЭ [11]. Также в этом исследовании подчеркивается значимость E-cad в поддержании целостности плацентарного барьера и обсуждается возможность использования Е-cad как маркера ПЭ.
Противоположные данные при исследовании плацент были получены в исследованиях Li H.W. et al. (2003) [12] и Li X.L. et al. (2014) [13], где отмечалась повышенная экспрессия Е-cad при беременности, осложненной ПЭ. Аналогичные данные получил Du. L. et al. (2017) [14]. Однако в существующей научной литературе нами не найдено исследований, анализирующих взаимосвязь мембранной формы E-cad и sE-cad.
В нашем исследовании мы обнаружили повышенный уровень sE-cad в плазме крови и плаценте при беременности, осложненной ПЭ. Высокий уровень экспрессии E-cad сочетается с усилением пролиферации цитотрофобласта и подавлением его дифференцировки в синцитиотрофобласт, а нарушение дифференцировки ведет к апоптозу цитотрофобласта и синцитиотрофобласта [13]. Апоптоз сочетается с разрушением адгезионных связей клеток трофобласта, увеличением в кровотоке уровня sE-cad и повышением проницаемости плацентарного барьера. Таким образом, уровень растворимой формы E-cad отражает патологические изменения в трофобласте при ПЭ.
Заключение
Итогом проведенного нами исследования явилось установление возможной роли E-cad в патогенезе ПЭ. Дальнейшие исследования позволят уточнить диагностическую и прогностическую значимость данной молекулы при ПЭ.
