Работа частично поддержана Государственными контрактами Минобрнауки РФ №16.522.12.2009 от
29.09.2011 и №16.512.11.2093 от 22.02.2011
Ведущая роль в развитии послеродовых инфекционно-воспалительных заболеваний принадлежит
восходящей бактериальной инфекции влагалища, частота которой в популяции варьируется от 15 до 30% [3, 5]. Вопросы объективной оценки состояния влагалищной микрофлоры у беременной женщины, определение необходимости санации или коррекции биоценоза, профилактики инфекционных осложнений являются актуальными и требуют дальнейшего изучения [6]. Применение молекулярно-генетических методов, основанных на полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ), позволяет расширить спектр выявляемых микроорганизмов и провести количественное определение доли условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) в составе микробиоценоза [1, 4, 7]. В значительной степени
необходимость санации беременных женщин определяется и тяжестью воспалительного процесса. В настоящее время помимо осмотра для оценки степени воспалительного процесса используют микроскопию окрашенных мазков. Результаты данного теста являются субъективными и зависят от квалификации исполнителя. Поэтому вопросы альтернативных способов диагностики воспалительных заболеваний нижних отделов репродуктивной системы женщин остаются актуальными.
Воспалительная реакция возникает вследствие активации клеток иммунной системы в связи с
персистенцией патогенных и УПМ на слизистой оболочке влагалища, что отражается на спектре экспрессируемых клетками цитокинов. Цитокины являются медиаторами взаимодействий клеток иммунной системы хозяина, принимают участие в активации иммунитета, направленного на уничтожение чужеродных микроорганизмов и поэтому могут быть использованы в качестве маркеров воспалительного процесса.
Целью настоящего исследования явилось изучение возможности объективной оценки интенсивности локального воспалительного процесса во влагалище беременных женщин с доношенной беременностью перед родами по профилю экспрессии мРНК генов цитокинов.
Материал и методы исследования
Было выполнено когортное проспективное исследование, охватывающее от 10 до 3 дней до родоразрешения. В исследование включена 101 беременная женщина, взятая под наблюдение при доношенной (37–41 нед) беременности. Критериями исключения из исследования были: наличие ВИЧ-инфекции, сифилиса, гепатитов В и С, ВПЧ, ВПГ, абсолютных патогенов (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis); женщины с тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологией, после хирургической коррекции истмико-цервикальной недостаточности (ИЦН); беременные, которым проводилось лечение вагинальной инфекции в течение 1 мес до данного исследования, и пациентки с преждевременным излитием околоплодных вод.
На основании клинико-лабораторных данных (данные клинического осмотра, состояние микробиоценоза влагалища и местная лейкоцитарная реакция) пациентки были разделены на две группы. Группу 1 составили 77 условно здоровых женщин без жалоб, без клинической картины воспаления влагалища при отсутствии лейкоцитарной реакции, по данным микроскопического исследования. По данным ПЦР-РВ, в составе биоценоза влагалища у всех пациенток данной группы преобладала нормофлора – лактобактерии составляли не менее 80%. В группе 1 у 42 беременных (подгруппа 1А) выделения из половых путей отсутствовали или были умеренными, отсутствовали Сandida spp. и Mycoplasma hominis, а число Ureaplasma spp. не превышало 104 ГЭ/образец. При анализе уровня экспрессии генов цитокинов подгруппу 1А использовали как референс-группу.
У 35 пациенток наблюдались обильные выделения из половых путей (подгруппа 1Б). Среди них
у 8 пациенток Candida spp. и Ureaplasma spp. не были обнаружены, у 16 – выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/образец, а у 11 — число Candida spp. превышало 103,5 ГЭ/образец, что на фоне отсутствия воспалительной реакции было расценено как бессимптомное носительство грибов.
В группу 2 были включены 24 беременные с признаками воспаления слизистой оболочки влагалища.
У всех пациенток отмечались чувство жжения и зуд наружных половых органов, набухание и гиперемия слизистой оболочки влагалища. У 6 пациенток этой группы наблюдали анаэробный дисбиоз (доля облигатно-анаэробных УПМ превышала 20%), у 9 пациенток на фоне сохраненной нормофлоры выявлена Candida spp. в количестве более 103,5 ГЭ/образце и у 9 женщин отклонений в структуре биоценоза влагалища выявлено не было.
Качественный и количественный состав микробиоты влагалища исследовали с помощью ПЦР-РВ.
Для исследования брали соскобы заднебоковых стенок влагалища в пробирки с физиологическим
раствором. Выделение ДНК проводили с помощью набора реагентов «Проба ГС» («ДНК-Технология»,
Россия). Определение состава микробиоты проводили с помощью набора реагентов «Фемофлор»
(«ДНК-Технология», Россия), согласно инструкции. При количественной оценке биоценоза влагалища учитывали общую бактериальную массу, массу Lactobacillus spp. и 14 основных групп микроорганизмов, представляющих условно-патогенную флору: Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp. и Candida spp. У всех включенных в исследование беременных было подтверждено отсутствие абсолютных патогенов (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium) с помощью комплекта реагентов «TNC-комплекс» («ДНК-Технология», Россия).
Для изучения профиля экспрессии генов цитокинов брали соскоб с заднебоковых стенок влагалища. В целях предотвращения деградации РНК в качестве транспортной среды использовали раствор гуанидинтиоционата.
Количество мРНК генов цитокинов (IL-1B, TNF, IL-8, IL-18, IL-12A, IL-10, IFNG, TGF-B1, LIF, а также общего лейкоцитарного антигена CD45) в вагинальных соскобах оценивали методом количественной ОТ-ПЦР. В работе использовали реактивы «Проба НК» и «Наборы для обратной транскрипции и амплификации генов цитокинов методом ПЦР в режиме реального времени» («ДНК-Технология», Россия), согласно инструкции. Нормировка проведена по пяти референсным генам HPRT1, TBP, B2M, GUSB, ABL методом сравнения индикаторных циклов (метод ΔΔCq). За 1 было принято значение Ме в референс-группе.
В качестве меры центральной тенденции количественных признаков была выбрана медиана (Me),
а в качестве интервальной оценки – верхний (H) и нижний квартили (L). Результаты представлены
в виде Me (L-H). Для оценки значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна-
Уитни для несвязанных совокупностей.
Отношение шансов (OШ) и значимость различий в частоте встречаемости качественных признаков
(точный критерий Фишера) рассчитывали с помощью свободно распространяемого программного продукта WINPEPI (PEPI-for-Windows) версии 11.4. Отношение шансов приведено с 95% доверительным интервалом (ДИ).
Для построения канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) был выполнен дискриминантный анализ с использованием пакета программ Statistica 8.0 (StatSoft, США).
Для оценки эффективности классификации и качества модели был проведен ROC-анализ.
Непосредственная оценка эффективности модели была получена с помощью расчета численного
показателя площади под кривой (AUC) с помощью метода трапеций.
Для установления уровня отсечки (cut off) проводился пересмотр значений классификационной
функцииотмаксимальногодоминимальногозначения. Для каждого значения проводили разделение групп с определением чувствительности и специфичности. Критерием выбора порога отсечения
выбрано требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели.
Результаты исследования и обсуждение
Клиническая характеристика
Возраст беременных составил от 19 до 40 лет (в среднем 29,1±4,5 года). По перенесенным
соматическим и гинекологическим заболеваниям, осложнениям течения настоящей беременности
пациентки исследуемых групп были сопоставимы. При анализе репродуктивной функции было
установлено, что у 29 (28,7%) женщин имело место искусственное прерывание беременности,
у 11 (10,9%) – самопроизвольные выкидыши, у 13 (12,9%) – неразвивающиеся беременности.
Статистически значимых различий между группами выявлено не было.
Анализ течения настоящей беременности показал, что из осложнений в исследуемой группе
беременных угроза прерывания беременности в I триместре в подгруппе 1А отмечена у14 (33,3%)
пациенток, в подгруппе 1Б –у 11 (31,4%), в группе 2 – у 10 (41,6%). Угроза прерывания во II триместре в подгруппе 1А была у 12 (28,5%) пациенток, в подгруппе 1Б – у 6 (17,1%), в группе 2 – у 8 (33,3%). Угроза преждевременных родов в подгруппе 1А – у 5 (11,9%) женщин, в подгруппе 1Б – у 4 (11,4%), в группе 2 – у 1 (4,2%). Многоводие в подгруппе 1А – у 7 (16,6%), в подгруппе 1Б – у 9 (25,7%) и в группе 2 – у 7 (43,7%). Маловодие в подгруппе 1А – у 10 (23,8%), в подгруппе Б – у 4 (11,4%), в группе 2 – у 5 (31,3%) пациенток. Плацентарная недостаточность в подгруппе 1А – у 6 (14,3%), в подгруппе 1Б – у 8 (22,8%) и в группе 2 – у 5 (31,3%) женщин. Преэклампсия в группе 1А – у 12 (28,6%), в подгруппе 1Б – у 9 (25,7%) и в группе 2 – у 6 (37,5%) женщин.
Кроме того, по анамнестическим данным, в I и/или II триместрах настоящей беременности
у пациенток диагностировали нарушения микробиоценоза влагалища в виде: вагинального кандидоза в подгруппе 1А – у 5 (11,9%), в подгруппе 1Б – у 6 (17,1%), в группе 2 – у 8 (50%) пациенток; бактериального вагиноза в подгруппе 1Б – у 2 (5,7%) беременных, в группе 2 – у 2 (12,5%) и ни одного случая в подгруппе 1А; неспецифического вагинита в подгруппе 1А – у 1 (2,4%) пациентки, в подгруппе 1Б – у 3 (8,6%) и в группе 2 – у 5 (31,3%) пациенток. Генитальные микоплазмы выявлены в группе 2 у 2 (12,5%) пациенток, в то же время в подгруппах 1А и 1Б не выявлено ни одного случая. Все беременные получали терапию в соответствии с существующими стандартами лечения.
Течение родов и послеродового периода
Структура методов родоразрешения не различалась между группами. В группе 1 через естественные родовые пути родоразрешены 43 (55,8%) беременных (24–57,1% и 19 – 54,3% по подгруппам соответственно). В группе 2 через естественные родовые пути родоразрешены 17 (70,8%) женщин. Остальным беременным выполнено кесарево сечение в нижнем маточном сегменте поперечным разрезом.
Наиболее значимые осложнения родов и послеродового периода у обследованных беременных представлены в табл. 1. Осложнения родов и послеродового периода достоверно чаще отмечены в группе беременных с признаками воспаления слизистой оболочки влагалища (p=1,3´10-5, OШ=10,4, 95% ДИ 3,28–32,94). При этом различия между подгруппами женщин без признаков воспаления не были статистически значимыми. Заслуживает внимания, что в подгруппе 1Б из 12 женщин с осложнениями родов и послеродового периода у 9 женщин выявлена уреаплазма в количестве более 104 ГЭ/образец. Таким образом, Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/образец может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода.
Также заслуживает внимания, что у женщин с бессимптомным носительством грибов не
было ни одного случая осложнений родов и послеродового периода. В то время как у женщин
с кандидозным вагинитом осложнения родов и послеродового периода отмечались у 7 (77,7%)
из 9 пациенток.
Наблюдаемая в нашем исследовании частота бессимптомного кандидоносительства при беременности согласуется с литературными данными, что более, чем в 40% случаях при беременности вульвовагинальный кандидоз носит характер бессимптомного кандидоносительства и не вызывает осложнений [9]. Таким образом, Candida spp. может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода только при наличии локальной воспалительной реакции.
Таблица 1. Осложнения родов и послеродового периода.
Как видно из данных, представленных в табл. 1, наиболее часто встречающимся осложнением родового акта явилось преждевременное излитие околоплодных вод, частота встречаемости которого статистически значимо не различалось между группами или подгруппами.
Разрывы мягких тканей родовых путей достоверно чаще наблюдались в группе 2 – у 7 (29,2%) по сравнению с 6 (7,8%) в группе 1 (p=0,012, OШ=4,87, 95% ДИ 1,48–16,10). При анализе подгрупп наблюдали тенденцию к повышению частоты разрывов мягких тканей родовых путей у женщин с обильными выделениями (14,3% по сравнению с 2,4% у условно здоровых женщин), но данные различия не были статистически значимыми.
Общее число осложнений послеродового периода в группе с признаками воспаления слизистой
оболочки влагалища было статистически значимо более высоким (р=0,033) и составило 6 (25,0%)
случаев по сравнению с беременными без признаков воспаления, где осложнения пуэрперия наблюдали у 6 (7,8%) (OШ=3,94, 95% ДИ 1,16–13,44). Статистически значимых различий между подгруппами в группе 1 не наблюдали.
Для объективной оценки выраженности локальной воспалительной реакции был проведен анализ экспрессии генов цитокинов и общего лейкоцитарного антигена (CD45). Было обнаружено, что при наличии локальной воспалительной реакции (группа 2) повышены уровни экспрессии мРНК генов IL-1B – в 9,1, TNF – в 2,7, СD45 – в 6,7, IL-6 – в 13,1, LIF – в 5,9, IL-8 – в 6,1, IL-10 – в 5,2, IFNG – в 13,5 раз,
а уровни экспрессии мРНК генов TGF-B1 – в 1,8, IL-12A – в 1,7 и IL-18 – в 3,7 раза снижены по сравнению с контрольной группой (табл. 2).
Таблица 2. Сравнительный анализ профиля экспрессии мРНК генов цитокинов в вагинальных мазках в исследуемых группах и подгруппах беременных.
Профиль экспрессии генов цитокинов в вагинальных мазках женщин с обильными выделениями (подгруппа 1Б) не отличался от профиля пациенток контрольной группы (подгруппа 1А) за ислючением того, что при обильных выделениях без Ureaplasma spp. и Candida spp. ни в одном случае не была обнаружена мРНК IFNG. В подгруппе 1А таких пациенток было 19. Профиль экспрессии генов цитокинов в вагинальных мазках женщин с Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/образец не отличался от условно здоровых беременных. Бессимптомное носительство
Candida spp. в группе 1 сопровождалось достоверным повышением уровней IL-10 и IFNG в 2,8 и
4,6 раза соответственно и снижением уровня LIF в 4,3 раза по сравнению с контрольной группой, при этом повышения уровня провоспалительных цитокинов отмечено не было, что, по-видимому, связано с отсутствием воспалительной реакции.
Наличие статистически значимых различий в профиле экспрессии ряда цитокинов послужило основанием для попытки создания математической модели, позволяющей объективно оценить выраженность локальной воспалительной реакции. С помощью дискриминантного анализа были подобраны две канонические линейные дискриминантные функции (КЛДФ), уравнения которых имели вид:
КЛДФ 1=1,09´(IL-1B)–0,61х(IL-8)+0,21´(IL-10)–0,11´(IL-18)–0,91
КЛДФ 2=-0,59×TNF-0,88×СD45-0,56×LIF-0,21×(IL-10)+0,09´(IL-18)+0,87, где
КЛДФ 1, КЛДФ 2 – значения, соответствующей КЛДФ; IL-1B, IL-8, IL-10, IL-18, TNF, CD45, LIF – уровни экспрессии генов соответствующих цитокинов, нормированные на уровень экспрессии референсных генов.
Распределение женщин в зависимости от значений КЛДФ представлено на рис. 1 (см. на вклейке). Предложенная модель позволила удовлетворительно классифицировать беременных по наличию воспалительной реакции во влагалище. Для оптимизации диагностического алгоритма была рассмотрена возможность использования только одной функции (КЛДФ 1), содержащей наименьшее число переменных.
Для оценки диагностических возможностей предложенной модели с использованием
КЛДФ 1 был выполнен ROC-анализ. Область перекрытия значений КЛДФ 1 между референсгруппой и группой беременных с воспалительной реакцией была минимальной (рис. 2, см. на вклейке). Площадь под ROC-кривой (AUC) составила 0,995 (0,977—1,000, p<0,05). Данное значение, согласно экспертной шкале, позволило оценить предложенную модель как отличную. В качестве порогового значения (точка cut-off) выбрано значение, соответствующее максимальной сумме чувствительности и специфичности. Пороговое значение КЛДФ 1 составило 0,1.
Чувствительность и специфичность предложенной модели по разделению здоровых женщин и
пациенток с вагинитом в области порогового значения составили 95,8% и 100% соответственно.
Значения показателей КЛДФ 1 выше cut-off классифицировались как признак локальной воспали-
тельной реакции слизистой оболочки влагалища.
Таблица 3. Классификация исследуемых групп/подгрупп беременных женщин, согласно предложенной модели.
По результатам апостериорной классификации с использованием предложенной модели (табл. 3)
все пациентки референс-группы были классифицированы как условно здоровые беременные
без воспалительной реакции. За исключением одной пациентки все пациентки с вагинитами
были классифицированы как пациентки с воспалительной реакцией во влагалище. БSльшая
часть пациенток подгруппы 1Б с обильными выделениями были классифицированы как
пациентки без воспаления.
Полученные результаты свидетельствуют, что при воспалительных процессах во влагалище беременных женщин наблюдается выраженная реакция клеток вагинальных соскобов
в виде повышения уровней экспрессии ряда провоспалительных цитокинов (IL-1B, TNF, IL-6,
LIF, IL-8, IFNG), а также иммунорегуляторного IL-10 и общего лейкоцитарного антигена CD45.
Повышение экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45, по-видимому, ассоциировано
с увеличением числа лейкоцитов в мазках при вагинитах или отражает активацию иммунокомпетентных клеток.
Наблюдаемое повышение уровня провоспалительных цитокинов согласуется с современными представлениями об активации макрофагов, дендритных и других клеток УПМ. При взаимодействии высококонсервативных компонентов клеточных стенок («паттерны патогенности») микроорганизмов с паттерн-распознающими рецепторами, прежде всего с толл-подобными рецепторами TLR2, TLR4 на поверхности иммунокомпетентных клеток, происходит активация синтеза ряда провоспалительных цитокинов (TNF-а, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12) [1, 10]. Помимо этого дентритные клетки активируют наивные Th0-лимфоциты и способствуют их дифференцировке в эффекторные либо регуляторные Т-клетки, являющиеся частью адаптивного иммунитета. Дифференцировка Th0 в Th1-лимфоциты приводит к повышению экспрессии IL-2, IFNG, TNF-β и способствует усилению функций макрофагов по уничтожению УПМ. Дифференцировка Th0 в Th2-лимфоциты приводит к повышению экспрессии IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и др. и способствует выработке антител, в первую очередь иммуноглобулинов класса A. При Т-клеточном ответе синтезируются растворимые медиаторы, включая провоспалительные, противовоспалительные и регуляторные цитокины (IL-10, TGF-β1, IL-18 и т.д.), и другие иммуномодуляторы [8].
IL-12 и IL-18 регулируют дифференцировку лимфоцитов по Th1-пути, поэтому ожидалось, что при бактериальных и грибковых инфекциях данные показатели также будут повышены.
Вопреки ожиданиям, отмечено достоверное снижение уровня экспрессии мРНК данных цитокинов. Одной из возможных причин наблюдаемого феномена может быть то, что события, способствующие дифференцировке Th0-лимфоцтов в Th1-лимфоциты и их клональной пролиферации, осуществляются в лимфоидных органах, а не локально.
Заключение
Таким образом, показано, что помимо качественного и количественного состава микробиоты влагалища существенным фактором риска послеродовых осложнений является наличие локальной воспалительной реакции слизистой оболочки влагалища. Воспалительные заболевания нижних отделов репродуктивной системы беременных женщин сопровождаются изменением профиля экспрессии мРНК цитокинов. Повышаются уровни IL-1B, TNF, СD45, IL-6, LIF, IL-8, IL-10, IFNG, снижаются TGF-B1, IL-12A и IL-18, что позволяет использовать данные маркеры для оценки тяжести воспалительного процесса. В качестве объективного метода диагностики воспалительных заболеваний при беременности была предложена модель с использованием значения уровней экспрессии мРНК генов IL-1B, IL-8, IL-10 и IL-18. Определение профиля цитокинов в вагинальном отделяемом перед родами позволит своевременно предпринять меры по профилактике послеродовых воспалительных осложнений.
