Актуальность прогнозирования репродуктивных потерь (РП) в популяции не меняется на протяжении многих лет. В течение последних десятилетий исследуются различные прогностические критерии, в том числе социальные, клинические, лабораторные, генетические, молекулярные, которые могли бы послужить предиктором невынашивания беременности. В настоящее время имеющиеся сведения о морфологических изменениях при спонтанных выкидышах скудны [1].
В качестве прогностических лабораторных маркеров, по данным разных авторов, наиболее часто рассматриваются такие лабораторные параметры, как фибриноген, лейкоциты, интерлейкин-6 (ИЛ-6), тромбоциты, тромбомодулин (ТМ), ингибитор активатора плазминогена (ПАИ-1).
Фибриноген – растворимый белок плазмы, синтезирующийся в печени и принимающий непосредственное участие в формировании тромба. Роль фибриногена в патогенезе негативных исходов беременности подтверждена во многих исследованиях [2–6]. Однако прогностическое значение фибриногена остается дискутабельным. Представлены исследования, в которых фибриноген выделяется, как основной маркер прогнозирования [2, 5, 7], хотя по данным других работ, не отмечается статистически значимых изменений данного параметра [3, 6].
ИЛ-6 – представитель семейства цитокинов с плейотропным действием, участвующий в широком спектре физиологических процессов (воспаление, иммунные реакции и др.). Согласно литературным данным, является признанным воспалительным цитокином, опосредующим врожденный и адаптивный иммунитет и множество физиологических процессов, в том числе, связанных с беременностью [8, 9].
Количество тромбоцитов в единице объема крови является важнейшим параметром в оценке системного воспаления [10, 11]. При возникновении беременности различные иммунные эффекторы и молекулы, участвующие в иммунной микросреде, создают специфическую толерантность матери к плоду [12].
ТМ – мембранный белок, который экспрессируется на эндотелии, играет важную роль в поддержании сосудистого гомеостаза. Во время гиперкоагуляционного состояния после повреждения эндотелия ТМ высвобождается во внутрисосудистое пространство [13]. В настоящее время ТМ рассматривается, как один из наиболее чувствительных и специфичных предикторов в плане прогнозирования РП [14]. Описано прогностическое значение ТМ при нарушении внутрисосудистого гомеостаза, даже в отсутствие таких патологических факторов, как антифосфолипидный синдром и Лейденовская мутация, которые долгое время считались основными коагулопатическими причинами невынашивания у женщин [6, 15].
ПАИ-1 экспрессируется во вневорсинчатых интерстициальных трофобластах и сосудистых трофобластах. Во время имплантации и плацентации отвечает за ингибирование деградации внеклеточного матрикса, тем самым вызывая ингибирование инвазии трофобластов. Повышение ПАИ-1 в плазме определяется при привычном невынашивании беременности [16].
В связи этим важной является оценка лабораторных предикторов в ассоциации с морфологическими изменениями при неблагоприятных исходах беременности для стратификации группы риска неблагоприятного исхода на прегравидарном этапе.
Цель исследования: оценить взаимосвязь прогностических лабораторных маркеров крови и гистопатологических изменений при выкидышах в ранние сроки беременности.
Материалы и методы
Критерии отбора участников
Проспективное исследование было проведено на базе КГП «Областная клиническая больница» г. Караганды, Республика Казахстан, в период с января 2022 г. по май 2023 г.
В исследование были включены 269 женщин репродуктивного возраста, обратившихся за медицинской помощью в стационар по причине РП в сроке до 12 недель беременности.
Критерии включения: подтвержденный методами ультразвуковой диагностики неблагоприятный исход беременности либо самопроизвольное прерывание беременности в сроке до 12 недель; отсутствие экстрагенитальной патологии в анамнезе, острых воспалительных заболеваний, оперативного вмешательства на всем протяжении гестационного срока; отсутствие в анамнезе тяжелой соматической патологии и хронических заболеваний в стадии декомпенсации.
Критерии исключения: многоплодная беременность; внематочная беременность; выраженные аутолитические изменения или отсутствие/недостаточное количество (менее 5 поперечных срезов) ворсин хориона в образце.
Все ткани, полученные в результате медикаментозной индукции прерывания беременности, аспирации или выскабливания полости матки направлялись на гистологическое исследование в соответствии с национальными законодательными стандартами.
В каждом случае после завершения рутинных гистологических исследований были запрошены патологоанатомические заключения, микропрепараты и парафиновые блоки. Микропрепараты и парафиновые блоки были извлечены из архива гистологической лаборатории и сопоставлены с данными в формах запроса на лабораторию, которые были получены вместе с образцом и заархивированы в лаборатории. Также были извлечены и тщательно проанализированы патологоанатомические заключения. В случаях, когда имелись сомнения относительно качества патологоанатомического заключения, микропрепараты были пересмотрены.
По гистопатологическим изменениям было сформировано 5 групп исследования.
Группа 1 (n=106) – нарушения ветвления ворсин хориона и дисморфные ворсины хориона: крайне неровные формы/контуры ворсинок, наличие, по крайней мере, одной трофобластической инвазии и/или множественных инвагинаций [17, 18].
Группа 2 (n=31) – воспалительные изменения: острый и хронический виллит, острый интервиллозит, массивное перивиллозное отложение фибрина, хронический гистиоцитарный интервиллозит, лимфоплазмоцитарный децидуит, децидуальный васкулит [19, 20].
Группа 3 (n=25) – геморрагические/ишемические изменения и/или нарушения васкулогенеза: ранний сосудистый кариорексис, межворсинчатое кровоизлияние, геморрагический гестационный эндометрий, парабазальные инфаркты и кровоизлияния в базальную пластинку с парабазальными некрозами, тяжелая гипоплазия ворсин хориона (степень IIB) и аваскулярные ворсины (степень III) по классификации Hakvoort R.A. [21].
Группа 4 (n=39) – прочие: реактивная клеточная инфильтрация в децидуальной ткани, отек ворсин хориона с миксоидной стромальной дегенерацией, склероз/фиброз ворсин хориона, диффузное гидропическое увеличение ворсин хориона с гиперплазией трофобласта, неоплазия.
Группа 5 (n=68) – без патологии.
Лабораторное исследование маркеров крови
При обращении для госпитализации в стационар проводился сбор анамнеза, анализ электронного паспорта здоровья для исключения экстрагенитальной патологии и формирования группы исследования. После добровольного согласия пациентки на участие в исследовании проводился забор венозной крови, после чего полученный биоматериал направлялся для дальнейшего исследования в научно-исследовательский центр НАО «Медицинский университет Караганды». Образцы крови получены натощак. Исследование показателей тромбоцитов и лейкоцитов проводились на автоматическом гематологическом анализаторе XS-500i фирмы Sysmex Corporation (Япония). Параметры фибриногена были определены на автоматическом коагулометрическом анализаторе для in vitro диагностики ACL ELITE PRO фирмы Instrumentation laboratory (США). Показатели ТМ, ИЛ-6 и ПАИ-1 определялись в сыворотке крови хроматогенным иммуноферментным методом (ELISA) с применением наборов IVD и использованием роботизированных ИФА-систем Evolis от производителя Bio-Rad Laboratories (США) и роботизированных ИФА-систем Freedom EVO Clinical фирмы Tecan (Швейцария).
Гистологическое исследование
Перед гистологическим исследованием образцы тканей фиксировали в 10% формальдегиде при температуре 4°C в течение 24 ч, промывали водопроводной водой и обезвоживали с использованием серии спиртов возрастающей концентрации (70%, 90%, 95%, 100%). Затем образцы тканей погружали в ксилол и заливали в парафиновые блоки. Срезы тканей толщиной 3 мкм нарезали с помощью микротома и помещали на предметное стекло. Затем стекла депарафинировали и окрашивали.
Срезы тканей погружали в гематоксилин Майера на 15 минут, а затем промывали водой в течение 5 минут. После этого срезы подвергали окрашиванию эозином в течение 1 минуты.
Внутриматочная беременность подтверждалась, если в дополнение к другим тканям, таким как децидуальная ткань или секреторный эндометрий, были идентифицированы фетальные ткани или ворсины хориона. Ворсины хориона были идентифицированы гистологически в соответствии с номенклатурой, предложенной Фогелем (1996).
Заявление об этике
Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) Всемирной медицинской ассоциации. Исследование одобрено Этическим комитетом Медицинской школы НАО «Карагандинский медицинский университет», № 23. Экспериментальных вмешательств и изменений в протоколах исследования не проводилось. Перед включением в исследование от всех пациентов было получено письменное информированное согласие.
Статистический анализ
Статистический анализ проведен с использованием пакета статистических программ Statistica 12.6 и IBM SPSS Statistics (версия 26, IBM, Armonk, NY, USA).
Все количественные переменные были проанализированы для проверки распределения (критерий Shapiro–Wilk). Данные представляли с использованием методов описательной статистики: количественные данные с распределением, отличным от нормального – с помощью медианы (Median), верхнего и нижнего квартилей (Q1 и Q3) и диапазона (Range); категориальные данные – в виде абсолютных чисел и процентного соотношения (доли) ко всей группе. Сравнительный анализ количественных переменных в непарных (независимых) группах c распределением, отличным от нормального, проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Все значения p были скорректированы для множественных парных сравнений по количеству тестов с использованием поправки Бонферрони (p=0.005). Для сравнения групп по категориальным переменным использовали непараметрический метод вычисления критерия χ2 (хи-квадрат) Пирсона, при числе степеней свободы=1 применялась поправка на непрерывность (Йетса), при небольшом количестве наблюдений (меньше 5) использовался точный критерий Фишера.
Результаты
Клинические характеристики женщин
По гистопатологическим изменениям в исследуемых группах в 39,4% образцов ткани выявлены нарушения ветвления и дисморфные ворсины хориона, в 11,5% – воспалительные изменения, в 9,3% – геморрагические/ ишемические поражения и/или и нарушения васкулогенеза, в 14,5% – прочие гистопатологические изменения и в 25,3% гистопатологических признаков патологии не выявлено.
Гистопатологические изменения при ранней потере беременности и клинические характеристики женщин представлены в таблице 1.
В группе 1 (Нарушения ветвления и дисморфные ворсины хориона) медиана количества беременностей составила 4 (Q1–Q3: 2–5, диапазон: 1–8), медиана количества родов – 2 (Q1–Q3: 0–3, диапазон: 0–6). Медианный срок гестации – 68 дней, медианный возраст женщин в группе – 27,5 года. Большинство пациенток – 78/106 (73,6%) – было азиатского происхождения, 28/106 (26,4%) – европеоидного. Более половины женщин 68/106 (64,2%) имели нормальный индекс массы тела (ИМТ), 18/106 (17,0%) – избыточный вес, 12/106 (11,3%) – недостаточный вес, 8/106 (7,5%) страдали ожирением.
В группе 2 (Воспалительные изменения) медиана количества беременностей составила 3 (Q1–Q3: 2–4, диапазон: 1–7), медиана количества родов – 1 (Q1–Q3: 0–2, диапазон: 0–4). Медианный срок гестации – 67 дней, медианный возраст женщин – 26,5 года. 21/31 (67,7%) пациенток было азиатского происхождения, 10/31 (32,3%) – европеоидного. Большинство женщин 18/31 (58,1%) имело нормальный ИМТ, 6/31 (19,4%) – недостаточный вес, 5/31 (16,1%) – избыточный вес, 2/31 (6,5%) – ожирение.
В группе 3 (Геморрагические/ишемические изменения и/или нарушения васкулогенеза) медиана количества беременностей составила 3 (Q1–Q3: 2–5, диапазон: 1–7), медиана количества родов – 1 (Q1–Q3: 0–4, диапазон: 0–5). Медианный срок гестации – 66 дней, медианный возраст женщин в группе – 28 лет. 19/25 (76,0%) пациенток были азиатского происхождения, 6/39 (24,0%) – европеоидного. Более половины женщин 17/25 (68,0%) имели нормальный ИМТ, 4/25 (16,0%) – избыточный вес, 2/25 (8,0%) – недостаточный вес, 2/25 (8,0%) – ожирение.
В группе 4 (Прочие) медиана количества беременностей составила 3 (Q1–Q3: 2–5, диапазон: 1–7), медиана количества родов – 1 (Q1–Q3: 0–3, диапазон: 0–6). Медианный срок гестации – 72 дня, медианный возраст женщин – 28 лет. 29/39 (74,4%) были азиатского происхождения, 10/39 (25,6%) – европеоидного. 22/39 (56,4%) женщин имели нормальный ИМТ, 8/39 (20,5%) – избыточный вес, 5/39 (12,8%) – недостаточный вес, 4/39 (10,3%) – ожирение.
В группе 5 (Без патологии) медиана количества беременностей составила 3 (Q1–Q3: 2–5, диапазон: 1–6), медиана количества родов – 1 (Q1–Q3: 1–3, диапазон: 0–5). Медианный срок гестации – 68 дней, медианный возраст женщин – 27 лет. Более половины пациенток – 44/68 (64,7%) – имели азиатское происхождение, 24/68 (35,3%) – европеоидное. 44/68 (64,7%) женщин имели нормальный ИМТ, 14/68 (20,6%) – избыточный вес, 6/68 (8,8%) – недостаточный вес, 4/68 (5,9%) страдали ожирением.
Лабораторные параметры крови женщин
Уровень ИЛ-6 в крови был статистически значимо выше в группе 2 (Воспалительные изменения) по сравнению с другими группами (p<0.005). Медиана показателя ИЛ-6 в группе 2 составила 7,090, межквартильный размах (Q1–Q3): 5,730–8,715. В 19 (61,3%) случаях в группе 2 наблюдался массивный острый воспалительный инфильтрат, как в ворсинах хориона, так и в децидуальной ткани (рис. 1 а, b). В 5 (16,1%) случаях выявлен умеренный и диффузный воспалительный инфильтрат, в основном характеризующийся макрофагами, лимфоцитами и нейтрофилами в децидуальной оболочке. В 7 (22,5%) образцах дополнительно наблюдались области некроза. Выявление иммунных клеток в децидуальной ткани является нормальным явлением при выкидыше; однако в данных случаях была обнаружена значительно более массивная и обширная инфильтрация тканей, характерная для децидуита, по сравнению с группой 4 (Прочие).
Уровень ТМ был значительно выше в группе 3 (Геморрагические/ишемические изменения и/или нарушения васкулогенеза) по сравнению с другими группами (p<0.005). Медиана показателя ТМ в группе 3 составила 8,360, межквартильный размах (Q1–Q3): 7,120–9,030. В 4 (16%) образцах были выявлены признаки раннего сосудистого кариорексиса и межворсинчатого кровоизлияния. В 7 (28%) образцах определены парабазальные инфаркты и кровоизлияния в базальную пластинку (рис. 1 e, f).
Васкуляризация в 15 (60%) образцах группы находилась в диапазоне от тяжелой гипоплазии в 10 (66,7%) образцах (преимущественно аваскулярные ворсины хориона с наличием в одной ворсине хориона сосудов с одним или несколькими эритробластами) до аваскулярности в 5 (33,3%) образцах (рис. 1 g, h).
Остальные показатели (лейкоциты, тромбоциты, ПАИ-1 и фибриноген), статистически значимо не различались во всех группах исследования (p>0,005) (табл. 2).
Обсуждение
Наиболее важным результатом данного исследования является выявление высокого уровня ИЛ-6 и ТМ, как маркеров воспалительных и геморрагически/ишемических гистопатологических изменений при ранних потерях беременности.
Установлено статистически значимое отличие уровня ИЛ-6 в образцах с воспалительными гистопатологическими изменениями, по сравнению с другими группами исследования (p<0,005). Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными Zhang M. et al. (2017), где была продемонстрирована значимая корреляция между изменениями ИЛ и РП и озвучены рекомендации по внедрению параметров ИЛ-6, как важного критерия для прогнозирования привычного невынашивания беременности [9]. В исследовании установлены медиана и межквартильные размахи ИЛ-6 в группе воспалительных изменений, составившие 7,090 (5,730–8,715), что может служить предпосылкой к формированию референсных значений для прогнозирования или диагностики воспаления, а также расширяет и дополняет диагностику причин нарушенной беременности раннего срока.
Для ТМ в группе геморрагических/ишемических изменений и/или нарушений васкулогенеза медиана и межквартильные размахи составили 8,360 (7,120–9,030), что значительно выше, чем в других группах исследования (p<0,005). ТМ рекомендован в качестве «золотого стандарта» в прогнозировании РП [14, 15]. В данном исследовании мы установили ассоциацию высокого уровня ТМ с гистологическими васкулярными повреждениями, что открывает возможности для изучения патогенеза данных повреждений. Результаты подчеркивают важность ТМ, как ключевого маркера, который может не только прогнозировать РП, но и помогать в понимании сложных биологических процессов, лежащих в основе васкулярных нарушений.
По результатам исследования констатирована тенденция к тяжелой гиповаскуляризации и аваскуляризации ворсин хориона в группе с повышенным уровнем ТМ. В литературе описано, что васкуляризация ворсин хориона может снижаться после гибели плода при посмертных аутолитических изменениях [22, 23]. Однако в данном исследовании гипоплазия сосудистой системы со значительно меньшим количеством сосудов и наличием преимущественно гиповаскулярных/аваскулярных ворсин хориона наблюдалась преимущественно в группе с высоким уровнем ТМ. На основании полученных результатов можно заключить, что наблюдаемые изменения сосудов в ворсинах хориона являются следствием патологического развития, вызванного аномальным «дефективным» васкулогенезом, а не посмертными изменениями. Высокий уровень ТМ может способствовать «дефективному васкулогенезу» или быть маркером процесса, который приводит к нарушению васкулогенеза, независимо от аутопсийных изменений. Это указывает на то, что ТМ играет специфическую роль в нарушении формирования сосудистой системы ворсин хориона. Данные положения требуют проведения дальнейших исследований.
Ключевые преимущества этого исследования заключаются в использовании стандартизированной гистологической номенклатуры и большом объеме выборки.
К слабым сторонам исследования можно отнести тот факт, что выборка представляла собой серию случаев в одном учреждении, а описания патологии преимущественно основывались на заключениях, предоставленных патологами в рутинной работе. Другим ограничением было отсутствие группы сравнения от прерванной беременности по социальным и медицинским показаниям или желанию женщины.
Заключение
Повышение уровня ИЛ-6 следует рассматривать, как маркер воспалительного повреждения при ранней потере беременности, а высокий уровень ТМ – как маркер геморрагически/ишемического повреждения и дефективного васкулогенеза. Мониторинг уровня этих маркеров позволит выявлять женщин, находящихся в группе высокого риска, что даст возможность провести целенаправленное обследование и коррекцию потенциальных факторов, влияющих на неблагоприятное течение беременности.
