Преждевременную недостаточность яичников (ПНЯ) определяют как состояние потери функциональной активности яичников в возрасте женщины до 40 лет [1]. Согласно данным систематического обзора и метаанализа 2023 г., последние 20 лет сохраняется тенденция по увеличению глобальной распространенности ПНЯ, и на сегодняшний день этот показатель составляет 3,5% женского населения [2]. Базовой стратегией ведения женщин с данной патологией является длительная заместительная гормональная терапия (ЗГТ) половыми стероидами до среднего возраста естественной менопаузы, которая имитирует нормальную функцию яичников [3]. Подходы к назначению тех или иных доз и состава ЗГТ при ПНЯ в настоящее время являются предметом дискуссии. Однако, согласно основным руководящим документам, пациенткам с ПНЯ обычно требуются более высокие дозы гормональных препаратов (в частности, эстрогенов), чем те, которые назначают женщинам со своевременной менопаузой [1–4]. Наше предыдущее исследование показало, что наиболее часто женщинам с ПНЯ в качестве ЗГТ назначали 2 мг перорального эстрадиола (Е2) в составе препарата E2/дидрогестерон (DYD) 2 мг/10 мг [5]. Однако эффективность данной терапии и удовлетворенность пациенток проводимым лечением существенно различались. У части пациенток сохранялись признаки тяжелого эстрогенодефицита, несмотря на регулярный прием ЗГТ.
Известно, что на эффективность и безопасность лекарственной терапии влияют различные клинические и демографические факторы, такие как пол, этническая принадлежность, возраст, вес, лекарственные взаимодействия и др. [6]. Наряду с этим ответ на лечение зависит от генетических особенностей человека, в частности, наличия вариантов генов ферментов, участвующих в процессах биотрансформации лекарственных средств (ЛС). Активность системы биотрансформации является основным фактором, который определяет фармакокинетику ЛС, а значит, фармакологический ответ пациента на терапию [6, 7]. Исследования показали, что четыре из пяти пациентов, вероятно, являются носителями генетических вариантов, которые могут изменить эффективность назначаемых ЛС [7].
Большое клиническое значение имеют методы фармакогенетического тестирования (ФГТ), когда с помощью молекулярно-генетических маркеров можно выявить индивидуальные особенности пациента, определяющие его ответ на назначаемую терапию [8]. В настоящее время ФГТ уже позволило разработать персонализированные алгоритмы назначения ЛС при различных патологиях [9, 10].
Фармакогенетика менопаузы и ПНЯ находится на ранней стадии развития. Препараты ЗГТ, как и менопаузальной гормональной терапии (МГТ), метаболизируются по тем же принципам, что и другие ЛС: под действием ферментов системы детоксикации ксенобиотиков I и II фазы они превращаются в активные соединения, которые обеспечивают терапевтический эффект, а затем в виде метаболитов элиминируют из организма [11]. Изучение вариантов в генах, ответственных за детоксикацию экзогенных эстрогенов, было связано в основном с их ролью в развитии нежелательных явлений, в том числе рака молочной железы на фоне МГТ у женщин в постменопаузе [12, 13].
Исследования по изучению индивидуальных различий в ответе на МГТ еще более ограничены. Степень эффективности МГТ у пациенток в постменопаузе в зависимости от вариантов в генах, связанных с метаболизмом эстрогенов, были изучены в крупномасштабном исследовании Kronos Early Estrogen Prevention Study (KEEPS). Результаты данной работы показали, что определенные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в гене SULT1A1, кодирующем фермент сульфотрансферазу 1A1 (SULT1A1) II фазы детоксикации экзогенных эстрогенов, связаны с более ранним возрастом наступления менопаузы, а также с большей эффективностью МГТ в отношении нарушений сна и ночной потливости [14]. Исследований по изучению влияния вариантов в генах системы детоксикации на эффективность ЗГТ у женщин с ПНЯ ранее не проводили.
Цель исследования: оценить влияние полиморфизма генов системы детоксикации ксенобиотиков (GSTP1 А313G, GSTP1 C341T, GPX1 C599T, EPHX1 T337C, EPHX1 A416G, SOD2 T47C, NAT2 A590G, NAT2 A857G, SULT1A1 A638G, CYP1A1 A1506G, CYP1A1 T6235C) на эффективность ЗГТ у пациенток с ПНЯ.
Материалы и методы
Исследование было проведено на базе ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России и одобрено локальным этическим комитетом. В исследование вошли 83 женщины с ПНЯ, у которых на фоне приема ЗГТ E2/DYD 2 мг/10 мг сохранялись симптомы эстрогенодефицита. Все пациентки подписали информационное согласие на участие в исследовании.
Отбор пациенток проводили в соответствии с критериями включения и невключения.
Критерии включения в исследование: нормальный кариотип; спонтанная ПНЯ; длительность приема ЗГТ не менее 6 месяцев; возраст ≥18 и <45 лет.
Критерии невключения в исследование: ятрогенная ПНЯ; тяжелая соматическая патология; наличие противопоказаний к ЗГТ (в соответствии с клиническими рекомендациями МЗ РФ «Менопауза и климактерическое состояние у женщины» 2021 г. и инструкций к лекарственным препаратам); патология щитовидной железы с декомпенсацией ее функции; диагностированное психическое расстройство, психофармакотерапия в настоящее время; прием пищевых добавок, содержащих зверобой.
Диагноз ПНЯ был установлен пациенткам в соответствии с диагностическими критериями, принятыми в 2016 г. Европейским обществом репродукции и эмбриологии человека (ESHRE): олиго/аменорея в течение не менее 4 месяцев, уровни фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) >25 мМЕ/л, подтвержденные дважды с интервалом в 4–6 недель, возраст женщин до 40 лет [15].
Тяжесть симптомов эстрогенодефицита определяли с помощью анкеты Климактерическая шкала Грина (Greene Climacteric Scale, GCS). Анализ крови на Е2 проводили методом иммуноферментного анализа на 2–3-й день индуцированного менструального цикла через 23–24 ч от приема очередной таблетки E2/DYD 2 мг/10 мг.
После проведенного обследования и оценки эффективности ЗГТ участницы исследования были разделены на 2 группы: в группу 1 (n=23) вошли пациентки, у которых на фоне ЗГТ E2/DYD 2 мг/10 мг сохранялись признаки тяжелого эстрогенодефицита (более 20 баллов по опроснику GCS и уровень Е2 в крови ниже нижней референсной границы лаборатории (150 пмоль/л), в группу 2 – все остальные пациентки (n=60).
Молекулярно-генетическое исследование проводили на базе лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ «НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова» МЗ РФ. В качестве материла для исследования использовали геномную ДНК, которую выделяли из периферической венозной крови, взятой с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в качестве антикоагулянта с помощью комплекта реагентов «Проба-ГС-генетика» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-964 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Анализируемые локусы представлены в таблице 1.
Статистический анализ
Статистический анализ данных был проведен с использованием программного пакета SPSS (IBM Statistical Package for the Social Sciences, 25 версия). Описательные статистики представлены в виде абсолютного числа наблюдений и % – для качественных переменных, медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q1; Q3) – для количественных. При анализе данных молекулярно-генетических исследований значимость различий в частоте встречаемости качественных признаков определяли с использованием критерия χ2. При оценке ассоциации аллеля с фенотипическим признаком сравнивали генотипические частоты анализируемого аллеля в группах пациентов с наличием и отсутствием данного признака. При наличии значимых различий в распределении аллелей проводили сравнение распределения генотипов в группах. При этом проверяли гипотезы об аутосомно-доминантном и аутосомно-рецессивном типе наследования анализируемого признака методом построения соответствующих моделей в виде четырехпольных таблиц. Для каждой таблицы рассчитывали точный тест Фишера (F) при количестве наблюдений в одной из ячеек менее 5 или критерий χ2. Проводили анализ сцепления полиморфизмов. Также проводили расчет отношения шансов (ОШ) проявления признака при соответствующем генотипе. За порог статистической значимости принимали результат со значением p<0,05.
Результаты
Пациентки групп 1 и 2 не различались по клинико-анамнестическим, антропометрическим данным (табл. 2).
Распределение генотипов соответствовало ожидаемым при равновесии Харди–Вайнберга для всех исследуемых генов. Распределение аллелей и генотипов полиморфных локусов генов системы детоксикации ксенобиотиков в зависимости от эффективности ЗГТ E2/DYD 2 мг/10 мг у пациенток с ПНЯ было следующим: частота аллеля А полиморфизма А313G гена GSTP1 в группе 1 (83%) была статистически значимо выше, чем в группе 2 (65%) (OШ=2,56, 95% ДИ 1,09–5,98, p=0,03). Согласно аутосомно-рецессивной модели наследования аллель А полиморфизма А313G гена GSTP1 был ассоциирован с низкой эффективностью ЗГТ и признаками тяжелого эстрогенодефицита (OШ=2,99, 95% ДИ 1,07–8,33, p=0,03). Частота аллеля C полиморфизма C341T гена GSTP1 в группе 1 была статистически значимо выше по сравнению с группой 2 (98% против 86% соответственно). Согласно аутосомно-рецессивной модели наследования ОШ=7,43, 95% ДИ 0,96–57,52, p=0,03.
Были также выявлены различия между двумя группами пациенток в отношении аллелей полиморфного гена GPX1 C599T, которые, однако, не достигли статистической значимости: 78% в группе 1 против 63% в группе 2 (ОШ=2,08, 95% ДИ 0,94–4,61, p=0,07). При этом согласно аутосомно-рецессивной модели наследования генотип С/С полиморфизма C599T гена GPX1 был ассоциирован с низкой эффективностью ЗГТ и признаками тяжелого эстрогенодефицита у пациенток (ОШ=3,02, 95% ДИ 1,11–8,23, p=0,03).
Необходимо отметить, что часть исследованных полиморфизмов гена GSTP1 имеют близкое друг к другу расположение на хромосоме (890 нуклеотидных последовательностей), что дало нам основание предположить возможность сцепленного наследования определенных аллелей. Был проведен анализ сцепления указанных выше полиморфизмов. Было выявлено сцепленное наследование полиморфных локусов Ile105Val и Ala114Val: D’=1.0 (0.75–1.0), LOD=7.24.
Был проведен поиск ассоциаций показателей эффективности ЗГТ с носительством гаплотипов по полиморфным локусам гена GSTP1 Ile105Val и Ala114Val. Частота встречаемости гаплотипов по полиморфизмам выбранного гена в группах исследования представлена в таблице 3.
Гаплотип AC чаще обнаруживали у пациенток группы 1 (69,6% по сравнению с 43,3% в группе 2; p=0,03, ОШ=2,99, 95% ДИ 0,97–9,80), а гаплотип GT – у пациенток группы 2 (3,3% по сравнению с 0,0% в группе 1, соответственно; p=0,03, ОШ=7,33, 95% ДИ 0,98–322,5). Таким образом, гаплотип АС можно рассматривать как фактор риска, а гаплотип GT – как протективный фактор низкой эффективности ЗГТ E2/DYD 2 мг/10 мг. Частота встречаемости гаплотипа GC значимо не различалась в исследуемых группах пациенток, поэтому его можно охарактеризовать как нейтральный фактор.
В результате проведения клинико-функциональной оценки генотипа по полиморфизмам гена GSTP1 A313G (Ile105Val) и С341Т (Ala114Val) было установлено, что сочетание двух протективных гаплотипов, протективного и нейтрального, а также сочетание протективного гаплотипа и гаплотипа риска (то есть носительство гаплотипа GT) расценивали как протективный генотип (ОШ=2,1, 95% ДИ 1,54–2,89, p<0,0001). Сочетание двух аллелей риска расценивали как генотип риска (ОШ=0,0, 95% ДИ 0,0–0,6, p=0,008). Сочетание аллеля риска и нейтрального аллеля, а также сочетание двух нейтральных аллелей расценивали как нейтральный генотип (табл. 4).
Известно, что стандартным подходом в рутинной клинической практике является определение одиночных нуклеотидов в точках-маркерах функционально значимых гаплотипов, а не самих гаплотипов, из-за технологической сложности и высокой стоимости такого исследования. Полный генотип устанавливают с учетом данных о сцеплении при наследовании определяемых точек-маркеров. Соответствие гаплотипов и индивидуальных генотипов GSTP1 A313G (Ile105Val) и С341Т (Ala114Val) приведены в таблице 5.
Маркером протективного гаплотипа является генотип -313 G/G, а маркером гаплотипа риска – генотип -341 C/C. Сочетание -313 G/G и -341 C/C, а также двух гетерозиготных генотипов является маркером нейтрального гаплотипа.
Обсуждение
По заявлению экспертов Международного общества по менопаузе (IMS) «Pharmacogenomics in personalized medicine: menopause perspectives», персонифицированный подход к лечению симптомов климактерического синдрома и состояний, связанных с менопаузой, должен базироваться, среди прочего, на фармакогеномике [16]. Данный подход поможет оптимизировать терапию эстрогендефицитных состояний, поскольку наблюдаются значительные межиндивидуальные различия в достаточной дозе Е2 в составе МГТ, необходимой для купирования симптомов эстрогенодефицита. Эффективные дозы ЗГТ, необходимые для купирования симптомов эстрогенодефицита и профилактики возраст-ассоциированных заболеваний (остеопороз, сердечно-сосудистые заболевания) у молодых женщин с ПНЯ/ранней менопаузой и женщин со своевременной менопаузой, могут различаться [16].
В рамках настоящего исследования был проведен генетический анализ вариантов генов I и II фаз детоксикации ксенобиотиков в ассоциации с параметрами эффективности ЗГТ E2/DYD 2 мг/10 мг у пациенток с ПНЯ. Ответ на терапию был ассоциирован с вариантами в гене GSTP1.
Ген GSTP1 ответственен за синтез фермента II фазы детоксикации ксенобиотиков глутатион-S-трансферазы P1. Данный фермент широко представлен во всех органах и тканях человеческого организма, исключая эритроциты [17]. Ген GSTP1 локализован на длинном плече 11-й хромосомы (11q13) и имеет два хорошо изученных полиморфизма, связанных с однонуклеотидными заменами кодирующих участков гена (1578A>G и 2293C>T): аденина на гуанин (A/G) в 5 экзоне (313 положение гена) и цитозина на тимин (C/T) в 6 экзоне (341 положение гена). Данные аминокислотные замены происходят в активном центре фермента, с чем связаны различия ферментативной активности белкового продукта для аллелей [18]. В ряде исследований была изучена частота встречаемости полиморфизмов гена GSTP1 в различных популяциях. Вариант GSTP1 114Val встречался примерно у 10%, вариант GSTP1 105Val – у 33% людей европеоидной расы [19]. Частота встречаемости гомозигот по аллелю «дикого типа» GSTP1 105Val среди европейцев составляет около 40–60% [20]. По данным литературы, наибольшую активность фермент глутатион-S-трансфераза P1 демонстрирует у людей, гомозиготных по аллелю «дикого типа» (А) (Ile/ Ile), несколько сниженная активность наблюдается у гетерозиготных носителей (Ile/Val), и наиболее низкая активность – у гомозиготных носителей мутантного аллеля (Val/Val) [21].
В нашем исследовании оба изучаемых варианта в гене GSTP1 были ассоциированы с ответом на проводимую ЗГТ E2/DYD 2 мг/10 мг. После проведенного анализа сцепления были выявлены статистически значимые различия в частоте встречаемости гаплотипов по полиморфизмам GSTP1 A313G (Ile105Val) и GSTP1 С341Т (Ala114Val): гаплотип AC чаще обнаруживали у пациенток с признаками тяжелого эстрогенодефицита, а гаплотип GT – у пациенток без признаков тяжелого эстрогендефицита на фоне ЗГТ. Для лучшей имплификации результатов в клиническую практику мы определили маркеры гаплотипа риска (генотип -341 C/C) и протективного гаплотипа (генотип -313 G/G) в отношении низкой эффективности ЗГТ E2/DYD 2 мг/10 мг.
Нам не удалось найти исследований, в которых изучалась связь вариантов в гене GSTP1 и эффективности гормональной терапии, в частности, ЗГТ у пациенток с ПНЯ. Однако, в исследованиях, где изучали эффективность лечения других нозологий, мы обнаружили схожие результаты. В частности, было показано, что однонуклеотидный полиморфизм GSTP1 A313G (Ile105Val) был ассоциирован с лучшим эффектом лечения циклофосфамидом у пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Это позволило авторам предположить, что сниженная ферментативная активность обеспечивает меньшую конъюгацию циклофосфамида и его последующее выведение, что создает более высокую терапевтическую концентрацию данного ЛС [22, 23].
Наиболее изучено влияние полиморфизма гена GSTP1 на эффективность различных химиотерапевтических агентов при онкологических заболеваниях. В исследовании Ji M. et al. сообщалось, что генотип АА полиморфного локуса GSTP1 A313G был связан с худшим ответом на неоадъювантную химиотерапию рака молочной железы, что авторы также объясняют более активными процессами конъюгации и выведения значительного количества активного лекарственного вещества из клетки [24]. Напротив, замена A→G полиморфизма гена GSTP1 Ile105Val была связана с лучшим ответом на химиотерапию на основе платины при распространенном немелкоклеточном раке легкого [25, 26], мелфалана при лечении множественной миеломы [27], а также химиотерапии при колоректальном раке [28]. Ассоциация вариантов в других генах сульфотрансфераз, приводящие к сниженной ферментативной активности, с большей эффективностью химиотерапии была подтверждена в метаанализе 21 РКИ с общим числом участников 4990 [29].
Следует отметить, что в литературе имеются данные о противоположных эффектах, которые связаны с вариантами гена GSTP1. К примеру, в исследовании McIlwain C.C. et al. носители аллельных вариантов GSTP1 (A/G + G/G) имели худший ответ на ингибиторы тирозинкиназы по сравнению с гомозиготными носителями аллеля «дикого типа» (А/А) [30]. Противоречивые результаты исследований могут быть связаны с тем, что варианты в гене GSTP1 и последующее изменение метаболической активности фермента субстратспецифичны. Это подтверждают данные, что вариант GSTP1 105Val был связан со снижением каталитической активности глутатион-S-трансферазы P1 по отношению к препарату тиотепа в 2 раза, а к хлорамбуцилу – в 15 раз [31]. Ishimoto T.M. и Ali-Osman F. в своей работе с использованием in vitro моделей показали, что цитопротективный эффект при воздействии на клетки химиотерапевтических агентов существенно изменяется в зависимости от вариантов гена GSTP1 и конкретных лекарственных препаратах в различных вариациях [32].
Интерес представляют результаты недавнего исследования на мышах с нокаутом по кластерам GSTP1 (Gstp1 / p2 -/-), в котором среди прочих результатов были получены данные о связи GSTP1 с активностью рецептора Е2 (ERα). Глутатион-S-трансферазы, образуя белковый комплекс с ERα, снижали общий потенциал связывания рецепторов с Е2 в 3 раза [33]. Таким образом, можно предположить, что вклад полиморфизма гена GSTP1 в ответ на ЗГТ у пациенток с ПНЯ может быть связан не с одним механизмом. Однако, учитывая ограниченность имеющихся данных, сложные механизмы всех этапов метаболизма ЛС и большое количество факторов, потенциально влияющих на эффективность терапии, нужны дополнительные исследования на большой выборке и, возможно, с большим числом генов.
Заключение
Варианты гена GSTP1 Ile105Val и Ala114Val играют значимую роль в формировании ответа на ЗГТ у пациенток с ПНЯ, вероятно, за счет регуляции интенсивности процессов детоксикации Е2. Результаты проведенного анализа соответствия гаплотипов и индивидуальных генотипов GSTP1 A313G (Ile105Val) и С341Т (Ala114Val) упрощают процесс проведения генетического тестирования в рутинной клинической практике.
Полученные данные, раскрывающие геномные основы вариабельности ответа на терапию, помогут в развитии персонифицированного подхода к назначению ЗГТ у пациенток с ПНЯ, поскольку носительство полиморфных вариантов гена GSTP1 можно рассматривать как фактор риска низкой эффективности стандартных доз Е2 в составе ЗГТ и необходимости назначения более высоких доз гормональных препаратов.
