Повышение эффективности программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у пациенток со сниженным овариальным резервом является самой актуальной проблемой репродуктивной медицины на сегодняшний день. Частота встречаемости «бедного» ответа яичников на гонадотропную стимуляцию в программах ЭКО неуклонно растет, достигая, по мнению ряда специалистов, от 5–6% до 35,1% среди всех пациенток, подвергающихся лечению [1, 2]. В первую очередь это обусловлено поздним репродуктивным возрастом женщин, планирующих деторождение после 35 лет; значительную роль в снижении функции яичников играют резекции яичников и другие оперативные вмешательства на репродуктивных органах, длительное применение терапии, особенно гонадотоксичной, аутоиммунные и другие соматические заболевания [3]. Вместе с тем у части пациенток видимые причины снижения овариального резерва не обнаруживаются; к тому же снижение резерва часто сопряжено с бесплодием неясного генеза [4]. Естественно, причины существуют, но они кроются в сложных и неизученных молекулярно-генетических и эпигенетических механизмах регуляции внутрияичникового фолликулогенеза и репродуктивной системы в целом [5]. Достаточно сказать, что снижение овариального резерва и преждевременная недостаточность яичников ассоциированы с синдромом ломкой Х-хромосомы, наблюдаемой у ряда пациенток [6]. Тем не менее в последние годы предпринимаются попытки активировать внутрияичниковый фолликулогенез как механическими способами, так и путем введения различных биологически активных средств, имеющих как системное, так и локальное воздействие при непосредственном введении в яичник [7, 8]. Наиболее перспективным, по мнению исследователей, может явиться применение клеточной терапии для активации функции яичников. Экспериментальные исследования на животных показали эффективность использования мезенхимальных стромальных клеток (МСК) для активации внутрияичникового фолликулогенеза [9]. Клинические данные немногочисленны, но они продемонстрировали положительный эффект от введения аутологичных стволовых клеток при «бедном» ответе яичников [10]. Хотя в литературе описаны примеры применения МСК, обладающих низкой иммуногенностью и высокой пролиферативной активностью в терапии преждевременной недостаточности яичников, вопросы безопасности этого вида терапии продолжают обсуждаться. Появление работ о механизмах терапевтического воздействия с помощью внеклеточных везикул (ВВ) вызвало смену парадигмы и сформулировало новое направление в клеточных технологиях – бесклеточные (decellularized) препараты. Открытые в 1967 г. Питером Вульфом ВВ были названы «тромбоцитарным мусором», удаляющим из клеток ненужные продукты. Последующие исследования показали, что ВВ – это структуры, секретируемые тканями и органами, которые способны передавать информацию между клетками. Передаваемая информация может позитивно влиять на клетку-реципиент, т.к. ВВ несут ряд биологически активных веществ, в том числе белки, липиды, сахара, нуклеиновые кислоты, микро-РНК, митохондриальные ДНК. Спектр действия ВВ сопоставим с таковым МСК; так, ВВ-МСК костного мозга и амниотической жидкости защищают гранулезные клетки от апоптоза с помощью миРНК: miR-21, miR-644-5P, miR-145-5P,
miR-10a, miR-222; они секретируют сосудисто-эндотелиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста-β, плацентарный фактор роста и участвуют в оогенезе [11–15]. Считается, что ВВ-МСК активируют яичники за счет индукции PI3K-AKT пути, который стимулирует фосфорилирование FOXO3a и FOXO1 в примордиальных фолликулах и гранулезных клетках [16]. Есть мнение, что ВВ- МСК запускают Hippo сигнальный каскад, ответственный за регуляцию клеточной пролиферации и апоптоз гранулезных клеток [17]. Исходя из предполагаемых механизмов действия ВВ, их использование для активации яичников при сниженном овариальном резерве представляется весьма перспективным направлением.
Мы представляем ряд клинических наблюдений использования ВВ мультипотентных МСК (ММСК) для активации функции яичников у пациенток репродуктивного возраста, имеющих сниженные параметры овариального резерва, «бедный» ответ в программах ЭКО и неудачные попытки достижения беременности. Всего процедуры введения ВВ в яичник проведены у 15 пациенток. В представленной работе рассматриваются 3 наиболее показательных случая. Обследование пациенток перед вступлением в программу ЭКО проводили стандартно, согласно Приказу Минздрава России от 31 июля 2020 г. № 803н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению».
Описание клеточного продукта
Получение и фенотипирование первичных культур ММСК из послеродовой плаценты женщин после физиологических родов проводились на базе Лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НМИЦ АГиП им. В.И. Кулакова».
Первичную культуру клеток выделяли из ткани плаценты, полученной после нормальных физиологических родоразрешений на доношенных сроках. От каждой из родильниц было получено информированное согласие. Биоэксплант плаценты промывали физиологическим раствором, механически измельчали и инкубировали с коллагеназой II типа (0,05%) в течение 2–3 ч. Полученную первичную культуру клеток осаждали центрифугированием и высевали на культуральную посуду, содержащую ростовую среду. В качестве ростовой среды использовали DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина и стрептомицина. Пассирование клеточной культуры проводили на 4–5-е сутки по достижении 80% конфлюэнтности. Для анализа иммунофенотипа ММСК человека использовали коммерческий набор антител к специфическим поверхностным антигенам CD90, CD73, CD105, CD20, CD14, CD45, CD34 (MSC Phenotyping kit human, Milteniy Biotec, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. После инкубации с антителами клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера и переносили в пробирки для проточной цитофлуориметрии. С помощью клеточного сортера S3e (BioRad, США) были получены гистограммы распределения числа клеток от уровня сигнала флуоресцентных антител. Полученные культуры ММСК имели фенотип с преобладанием CD90, CD73, CD105 выше 95%.
ВВ получали из кондиционированной культуральной среды ММСК на 3–4 пассажах. Для этого ММСК инкубировали сутки с ростовой средой, которую предварительно очищали от ВВ фетальной бычьей сыворотки дифференциальным центрифугированием с использованием ультрацентрифуги Avanti JXN-30 (Beckman, США) на ×108 000 g. Кондиционированную среду затем отбирали и выделяли ВВ методом дифференциального центрифугирования, как было описано ранее [18]. Количество ВВ и их размер оценивали методом анализа траекторий наночастиц на приборе NanoSight NTA LM10 (Malvern Panalytical, Англия), a также по общему количеству белка, определяемого методом абсорбционной фотометрии при длине волны 280 нм. ВВ затем ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора и хранили на -80°С до использования. Одна терапевтическая доза для яичника содержала в среднем 5,2–5,6×1012 частиц в мл (что соответствовало 0,3–0,25 мг общего белка ВВ в мл), полученных из суточной кондиционной среды 11×107 ММСК.
Требование к донору биологического материала (послеродовой плаценты и пуповины)
Возраст 18–35 лет, самостоятельное наступление беременности, обследование в течение беременности в декретированные сроки на комплекс инфекций (I триместр или при постановке на учет в женскую консультацию – анализ крови на ВИЧ, гепатиты В и С, сифилис, TORCH-инфекции, мазок методом полимеразной цепной реакции на инфекции, микробиологический посев мочи на стерильность, мазок на флору из влагалища, посев из шейки матки или фемофлор 16); перед родоразрешением проведены клинический анализ крови, анализ крови на инфекции, взят посев из цервикального канала. При отрицательных результатах обследования на наличие инфекционного процесса материал послеродовой плаценты считался пригодным для дальнейшего применения.
Техника введения ВВ
Трансплантация ВВ в количестве 5,2–5,6×1012 частиц в 1 мл (что соответствует 0,3–0,25 мг общего белка ВВ в мл), полученных из суточной кондиционной среды 11×107 ММСК, в оба яичника интраовариально путем инъекции с помощью трансвагинальной пункции яичников.
Описание
Клиническое наблюдение 1. Пациентка Н.
Данные анамнеза и результаты обследования
Для проведения программы ЭКО обратилась пациентка в возрасте 34 лет. Предъявляет жалобы на отсутствие беременности в течение 8 лет регулярной половой жизни без применения контрацепции. Беременностей не было. Анамнез: родилась от 2 беременности, возраст родителей на момент деторождения 32 и 36 лет соответственно. Есть старший брат, не женат. Росла и развивалась нормально. Менархе в 14 лет. Менструации через 26–27 дней. Рост – 162 см, вес – 56 кг, индекс массы тела – 21,3 кг/м2. Половая жизнь с 21 года. Проведено обследование согласно действующим клиническим рекомендациям, причина бесплодия не установлена: менструальный цикл регулярный, овуляторный, маточные трубы проходимы, сперма партнера фертильна. Были зафиксированы сниженные параметры овариального резерва: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) – 12 МЕ/л, антимюллеров гормон (АМГ) – 0,67 нг/мл, суммарное количество антральных фолликулов меньше 5, что явилось основанием для достижения беременности методом ЭКО.
Результаты предыдущих попыток ЭКО
Проведены 3 попытки стимуляции яичников в протоколах с антагонистом гонадотропин-рилизинг-гормона (антГнРГ), суточная доза гонадотропина в день составила от 225 МЕ до 300 МЕ, на курс лечения суммарная доза гонадотропина составила от 2550 МЕ до 2775 ЕД; было получено 2–3 ооцита в каждой программе. Подробная характеристика эмбриологического этапа предыдущих программ представлена в таблице 1. Стоит отметить, что в одной из программ было получено 2 ооцита, при этом не произошло оплодотворения ооцитов; в другой – отсутствовало дробление эмбрионов, еще в одной – на 3-й день культивирования был перенесен эмбрион 6 бластомеров, но беременность не наступила. Таким образом, имела место типичная ситуация сниженного овариального резерва, «бедного» ответа на стимуляцию яичников, нарушение развития эмбрионов.
В рамках подготовки к программе ЭКО пациентке была проведена трансплантация ВВ. В правый яичник с помощью трансвагинальной пункции введены ВВ в количестве 5,2–5,6×1012 частиц в 1 мл (что соответствует 0,3–0,25 мг общего белка ВВ в мл), полученные из суточной кондиционной среды 11×107 ММСК.
В таблице 2 представлен анализ состояния овариального резерва пациентки исходно и через 30 дней после введения ВВ. Данные получены на 2-й день менструального цикла.
Полученные данные демонстрируют увеличение количества антральных фолликулов в правом яичнике, куда были введены ВВ, тогда как состояние левого яичника не изменилось. Закономерно повысился уровень эстрадиола и снизилось значение ФСГ, тогда как концентрация АМГ не изменилась.
Результаты программы ЭКО
Была проведена стимуляция яичников в программе ЭКО в течение 9 дней в протоколе с антГнРГ, доза гонадотропина в день составила 300 МЕ, на курс лечения – 2700 МЕ, из правого яичника получено 4 зрелых ооцита, из левого – ооцит не получен. Оплодотворение методом ИКСИ – 3 зиготы; на 5-й день культивирования в полость матки перенесена бластоциста 4АВ, эмбрион 4ВВ криоконсервирован. Наступила одноплодная беременность, которая прогрессирует.
Клиническое наблюдение 2. Пациентка Ш.
Данные анамнеза и результаты обследования
Пациентка, 37 лет, в анамнезе вторичное бесплодие, связанное с абсолютным трубным фактором, старшим репродуктивным возрастом. Из анамнеза известно, что у матери пациентки первый ребенок родился мертворожденным (мальчик), причина неизвестна, третья беременность – внематочная. Была проведена гистерэктомия в 40 лет по поводу миомы матки. Есть родной брат (41 год), у которого детей нет.
Бесплодие в течение 6 лет в первом браке. В 2019 г. пациентке проведена лапаротомия с тубэктомией по поводу внематочной беременности; в 2021 г. – лапароскопия с тубэктомией слева по поводу гидросальпинкса.
Имеются данные о проведении 8 программ ЭКО. Результаты последних четырех попыток представлены в таблице 3.
По данным спермограммы супруга – нормозооспермия.
Результаты предыдущих попыток ЭКО
Проведены 4 попытки стимуляции яичников в протоколах с антГнРГ, агонистом ГнРГ (аГнРГ). Было произведено 4 переноса эмбриона, беременность не наступала. Подробная характеристика эмбриологического этапа предыдущих программ представлена в таблице 4.
В рамках подготовки к программе ЭКО пациентке была проведена трансплантация ВВ. Суммарно в оба яичника введены с помощью трансвагинальной пункции ВВ в количестве 5,2–5,6×1012 частиц в 1 мл (что соответствует 0,3–0,25 мг общего белка ВВ в мл), полученные из суточной кондиционной среды 11×107 ММСК.
Результаты программы ЭКО
Была проведена стимуляция яичников в программе ЭКО в течение 8 дней по протоколу с антГнРГ; индуктор – фоллитропин альфа в дозе 150–300 МЕ/сут и человеческий менопаузальный гонадотропин в дозе 75 МЕ/сут на курс лечения – 2325 МЕ; из правого и левого яичника получено по 4 зрелых ооцита. Оплодотворение методом ИКСИ – 3 зиготы; на 5-й день культивирования в полость матки перенесена бластоциста 3АВ; еще 2 эмбриона (2АА) криоконсервированы. Наступила одноплодная беременность, которая прогрессирует.
Клиническое наблюдение 3. Пациентка С.
Данные анамнеза и результаты обследования
Обратилась пациентка в возрасте 33 лет для проведения программы ЭКО. Бесплодие 5 лет. Пациентка обследована согласно клиническим рекомендациям. Выставлен диагноз: Бесплодие I неясного генеза.
Из анамнеза: родилась от 1-й беременности. У отца – острый коронарный стеноз в 56 лет, у бабушки по маме – сахарный диабет I типа. Росла и развивалась нормально. Миопия средней степени. Хронический гастродуоденит, ремиссия. Менархе в 13 лет. Менструации через 26–28 дней по 4 дня. Половая жизнь с 21 года. Брак 1. Спермограмма – нормозооспермия.
Результаты предыдущих попыток ЭКО
Проведены 4 попытки стимуляции яичников в протоколах с антГнРГ, аГнРГ. Было произведено 4 переноса эмбрионов, беременность не наступала. Подробная характеристика эмбриологического этапа предыдущих программ представлена в таблице 5.
На момент обращения зафиксировано снижение овариального резерва (табл. 6).
В рамках подготовки к программе ЭКО пациентке была проведена трансплантация ВВ. В левый яичник с помощью трансвагинальной пункции введены ВВ в количестве 5,2–5,6×1012 частиц в 1 мл (что соответствует 0,3–0,25 мг общего белка ВВ в мл), полученные из суточной кондиционной среды 11×107 ММСК.
В таблице 6 представлен анализ состояния овариального резерва пациентки исходно и через 30 дней после введения ВВ. Данные получены на 2-й день менструального цикла.
Полученные данные демонстрируют увеличение количества антральных фолликулов в левом яичнике, куда введены ВВ, тогда как состояние правого яичника не изменилось. Закономерно повысился уровень эстрадиола и снизилось значение ФСГ, тогда как концентрация АМГ не изменилась.
Результаты программы ЭКО
Была проведена стимуляция яичников в программе ЭКО в течение 8 дней в протоколе с антГнРГ, доза гонадотропина в день составила 225–300 МЕ, на курс лечения – 2100 МЕ, из левого яичника получено 3 зрелых ооцита, из правого – 1. Оплодотворение методом ИКСИ – 3 зиготы; на 5-й день культивирования в полость матки перенесена бластоциста 4АВ, криоконсервация эмбрионов не производилась. Наступила одноплодная беременность, которая прогрессирует.
Обсуждение
Представленные наблюдения демонстрируют клинический успех в достаточно сложных и малоперспективных ситуациях сниженного овариального резерва, «бедного» ответа яичников и ранее неудачных программ ЭКО, когда специалисты предлагали пациенткам использовать ооциты донора. Хотя нами проведено введение ВВ уже 15 пациенткам со схожей клинической картиной, пока не получено доказательной информации эффективности метода. Действительно, относительно объективными критериями действия ВВ могут служить снижение концентраций ФСГ, соответствующее повышение уровня эстрадиола, визуальное увеличение количества антральных фолликулов. Насколько эти сведения можно считать объективными, или же это имеет место в пределах межцикловой вариабельности функции яичников, предстоит выяснить. Положительным явился факт визуализации увеличения количества антральных фолликулов именно в том яичнике, в который были введены ВВ, по сравнению с контралатеральным. На первом этапе нами была сознательно использована методика введения ВВ только в один яичник, показавшая воздействие субстрата на внутрияичниковый фолликулогенез. Тем не менее механизм действия ВВ пока рассматривается только предположительно, о чем свидетельствуют данные литературы, гипотетически представляющие возможное вовлечение в процессы роста фолликулов, от примордиальных до антральных, множества факторов, формирующих сигнальные пути внутрияичникового фолликулогенеза [16–18]. Обращает на себя внимание тот факт, что в наших наблюдениях уровень АМГ не изменился, а клинический эффект зарегистрирован через 30 дней после введения ВВ. Можно предположить, что активация происходит на более поздних этапах фолликулогенеза, на уровнях преантральных фолликулов, ведь созревание фолликулов от примордиальных до антральных занимает значительно больший период времени, не менее 120 дней. Исходя из этого предположения, возможно формирование клинических групп пациенток, у которых внутрияичниковое введение ВВ может быть эффективным способом активации яичников.
Заключение
Следует подчеркнуть, что, по нашему мнению, метод активации функции яичников путем введения ВВ является перспективным; скорее всего, единственно перспективным на сегодняшний день способом преодоления бесплодия у наиболее сложной группы пациенток, имеющих сниженные показатели овариального резерва и низкую частоту беременностей в программах ЭКО. Естественно, необходимо накопить и обобщить клинические данные и попытаться сформулировать патогенетическое обоснование использования клеточной терапии в клинической практике.
