Бесплодие является важной медико-социальной проблемой: по различным данным, от 5 до 15% супружеских пар во всем мире имеют проблемы с наступлением беременности в течение 1 года половой жизни без контрацепции. Причины бесплодия вариабельны, но в последние десятилетия все больше внимания ученых уделяется проблеме воздействия антропогенных химических веществ на репродукцию человека. Под антропогенным воздействием на окружающую среду понимают влияние хозяйственной деятельности человека на природу. К антропогенным химическим веществам относят тяжелые металлы, пестициды, различные органические соединения.
Некоторые тяжелые металлы (кадмий, ртуть, свинец) являются широко распространенными поллютантами и занимают лидирующие места в списке токсичности акта о природоохранных мерах CERCLA (англ. Comprehensive Environmental Response, Compensation, and Liability Act).
Известно, что негативное влияние тяжелых металлов на репродукцию может быть как прямым, так и опосредованным – например, через образование токсичных метаболитов. По данным литературы, повышенная экспозиция к тяжелым металлам связана с нарушениями менструального цикла, невынашиванием беременности, повышенным риском преждевременных родов [1, 2]. Данные о негативном влиянии тяжелых металлов на фолликулогенез, сперматогенез, функцию желтого тела и гипоталамо-гипофизарную систему получены в основном из исследований на моделях животных [3, 4]. При этом результаты исследований на человеке противоречивы, что может быть связано с гетерогенностью выбранных пациенток для исследования (в основном это пациенты клиник репродукции), небольшим объемом выборки, отсутствием учета множественных конфаундеров и малым количеством изученных веществ.
Цель данного исследования – проанализировать связь между уровнем тяжелых металлов (кадмий, ртуть, свинец) в крови пациенток с бесплодием и исходами программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Материалы и методы
В проспективное исследование была включена 301 супружеская пара, обратившаяся для лечения бесплодия с помощью ВРТ в период с 2017 г. по 2018 г., с отсутствием противопоказаний к проведению ВРТ, подписанным информированным согласием на участие в исследовании. Критериями включения явились нормальный кариотип обоих супругов, отсутствие выраженной патозооспермии (100% тератозооспермия, абсолютная астенозооспермия, все виды азооспермии), возраст женщины от 18 до 39 лет включительно, индекс массы тела (ИМТ) женщины от 19 до 25 кг/м2 включительно. Критериями исключения явились использование донорских гамет или суррогатного материнства, а также получение 3 и менее ооцитов в день трансвагинальной пункции яичников.
Все включенные в исследование супружеские пары были обследованы согласно приказу Минздрава России №107н от 30.08.2012 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» [3].
Овариальная стимуляция проводилась по протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона, доза гонадотропинов была подобрана индивидуально. Триггер овуляции вводили при наличии в яичниках фолликулов диаметром 17 мм и более. В качестве триггера овуляции использован хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) 8000–10 000 МЕ или агонист гонадотропин-рилизинг-гормона 0,2 мг. Поддержка лютеиновой фазы и посттрансферного периода у всех пациенток проведена по стандартному протоколу [5].
Забор венозной крови для проведения исследования осуществляли в день трансвагинальной пункции, после чего образцы подвергали криоконсервации при t=-70°С. Определение уровней ртути, кадмия и свинца осуществляли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, при этом лаборатория не имела доступа к клиническим характеристикам пациенток.
Оплодотворение ооцитов осуществляли с помощью инсеминации ооцитов in vitro («классическое» ЭКО, далее ЭКО – метод оплодотворения), или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) [5]. Во время оплодотворения проводили морфологическую оценку ооцитов, определяли наличие цитоплазматических дисморфизмов. К цитоплазматическим дисморфизмам относили наличие центральной гранулярности цитоплазмы, аномальных агрегатов гладкого эндоплазматического ретикулума в цитоплазме или вакуолей в цитоплазме. Культивирование и перенос эмбриона проводили согласно принятым в клинической практике методикам.
Через 14 дней после переноса в полость матки определялась концентрация ß-ХГЧ в сыворотке крови пациентки. При визуализации сердцебиения эмбриона через 5 недель после переноса эмбриона регистрировали клиническую беременность. Через 40 недель после переноса эмбриона проводили телефонный опрос пациенток для анализа исходов беременности. Под частотой наступления беременности понимали отношение числа клинических беременностей к общему числу циклов. Под частотой живорождения понимали отношение числа родов живым плодом к общему числу циклов. Под кумулятивной частотой живорождения понимали отношение числа живорождений в данном цикле и живорождений после переноса размороженных эмбрионов, полученных в данном цикле ЭКО или ИКСИ, к общему числу циклов.
Статистический анализ
Для статистического анализа использовался пакет статистических программ Statistica 10 (США). Данные с нормальным распределением представлены как среднее значение (стандартное отклонение). Статистический анализ проводился с применением χ2-теста для сравнения категориальных переменных, t-теста для сравнения средних величин. Данные с ненормальным распределением были представлены как медиана (интерквартильный размах). Мерой ассоциации для сравнения бинарных данных было отношение шансов (ОШ) с доверительным интервалом 95% (95% ДИ). Были созданы подгруппы пациенток по различному уровню металлов в крови в зависимости от квартильного значения (Q1: 0–25 перцентиль, Q2: 25–50 перцентиль, Q3: 50–75 перцентиль, Q4: 75–100 перцентиль). Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне р<0,05.
Исследование было одобрено комиссией по этике ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России.
Результаты
Распределение уровней кадмия, ртути и свинца в организме пациенток представлено в таблице 1.
Вначале была проанализирована связь между уровнем тяжелых металлов и клинико-анамнестическими характеристиками пациенток, включенных в исследование. Уровень кадмия был значимо выше у курящих пациенток по сравнению с некурящими (табл. 2).
Затем были проанализированы факторы, влияющие на наступление беременности в данной выборке пациенток. Для этого все пациентки были стратифицированы на 2 группы: группа 1 (n=137) – в данном цикле наступила клиническая беременность, группа 2 (n=164) – в данном цикле клиническая беременность не наступила. Полученные данные представлены в таблице 3. Основные клинические характеристики пациенток не различались значимо в группах сравнения. Единственным различием была длительность бесплодия, которая была статистически значимо выше у пациенток в группе с отсутствием наступления беременности.
Затем оценили влияние уровня тяжелых металлов на наступление клинической беременности, живорождения и кумулятивной частоты живорождения. Полученные данные представлены в таблицах 4–6.
При анализе полученных данных оказалось, что медианы уровней кадмия, ртути и свинца не различались у пациенток с разными исходами циклов ВРТ. Поэтому для проведения дальнейшего анализа были созданы подгруппы пациенток по различному уровню металлов в крови в зависимости от квартильного значения (Q1: 0–25 перцентиль, Q2: 25–50 перцентиль, Q3: 50–75 перцентиль, Q4 75–100 перцентиль). В подгруппах Q1–Q4 проводили оценку частоты получения ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами, частоты отмены переноса вследствие отсутствия дробления эмбрионов, а также частоты наступления клинической беременности, живорождения и кумулятивной частоты живорождения. Данные представлены в таблицах 7–9.
В различных квартильных подгруппах уровней кадмия наблюдали сравнимую частоту клинических исходов ВРТ – частоты наступления беременности, родов и кумулятивной частоты родов. Интересно отметить, что у пациенток с наиболее высоким уровнем кадмия (Q4) значимо чаще наблюдали отсутствие дробления эмбрионов, что может быть следствием влияния кадмия на генетические или метаболические изменения в ооцитах, которые, однако, не проявляются морфологически, так как частота цитоплазматических дисморфизмов ооцитов не различалась в квартильных группах. Отношение шансов (ОШ) отсутствия дробления эмбрионов при уровне кадмия Q4 составило 2,95 (95% ДИ 1,22–7,02).
При сравнении квартильных групп ртути не отмечено статистически значимых различий. Частота отсутствия дробления эмбрионов была несколько выше в группах Q1 и Q4, однако различия были незначимы (табл. 8).
Наблюдали снижение частоты наступления беременности и родов при повышении уровня свинца в организме женщины, хотя полученные различия не достигали статистической значимости (табл. 9, рис. 1).
Влияние повышения уровня кадмия на частоту цитоплазматических дисморфизмов ооцитов и отсутствие эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки, представлено на рисунке 2.
Обсуждение
Тяжелые металлы используются в хозяйственной деятельности человека в течение длительного периода времени. Часть тяжелых металлов в низких концентрациях необходима для человека и животных (например, железо, медь и цинк), другие же металлы (ртуть, кадмий, свинец) не принимают участия в метаболизме, однако обладают способностью накапливаться в различных тканях. Для тяжелых металлов характерны: широкая распространенность, токсичность, длительный период полувыведения и способность проникать через гистогематические барьеры. Высокая экспозиция к тяжелым металлам рассматривается как одна из причин постепенного снижения качества эякулята и повышения частоты встречаемости бесплодия.
В данном исследовании изучали ассоциацию между уровнями ртути, свинца и кадмия в крови женщины и исходами программ ВРТ. При оценке клинико-анамнестических характеристик пациенток была обнаружена связь между повышением уровня кадмия и курением пациентки. Курение может приводить к повышению уровня тяжелых металлов в организме, что показано в ранее проведенных работах [6].
При сравнении медиан уровней металлов у пациенток с различными исходами циклов ВРТ (в зависимости от наступления клинической беременности, родов, кумулятивной частоты родов) не было получено значимых различий. При этом повышение уровня кадмия связано с увеличением риска отсутствия дробления эмбрионов почти в 3 раза, а повышение уровня свинца (Q1→Q4) приводило к снижению частоты наступления беременности и родов на 10%.
Нужно отметить, что результаты подобных исследований в различных странах мира демонстрируют зачастую противоположные результаты [2, 7–10]. Имеющиеся в исследованиях противоречия можно объяснить сложностью изучения данной проблемы: различия в группах пациентов, в биологических образцах, методах исследования. Кроме того, на наступление беременности и родов влияет множество факторов, и даже при проведении крупных исследований возможно учитывать только основные. Поэтому ряд работ оценивают в качестве конечной точки только качество гамет и/или уровни стероидных гормонов [11–13]. Интереса заслуживают те исследования, в которых оценивают патогенетические механизмы влияния тяжелых металлов на стероидогенез, сперматогенез и ооцит-кумулюсные комплексы, однако эти исследования проведены на моделях животных и не могут быть полностью спроецированы на человека [3, 4]. Все вышеперечисленное подчеркивает необходимость дальнейшего изучения данной проблемы.
Заключение
По данным нашего исследования, повышение уровня кадмия связано с увеличением риска отсутствия дробления эмбрионов почти в 3 раза, а повышение уровня свинца (Q1→Q4) приводило к снижению частоты наступления беременности и родов на 10%. Следовательно, даже низкие дозы тяжелых металлов в организме пациенток могут оказывать токсическое воздействие на репродуктивную систему.
