Повышение эффективности методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) является актуальной задачей современной репродуктивной медицины. Поддержка лютеиновой фазы (ЛФ) стимулированного цикла – это интегральная часть программ ВРТ, во многом влияющая на ее результативность. Стимуляция овуляции приводит к недостаточности ЛФ в большинстве случаев, как в циклах с агонистом гонадотропин рилизинг гормона (аг-ГнРГ), так и с антагонистом ГнРГ (ант-ГнРГ) [1–3]. Недостаточность ЛФ оказывает отрицательное влияние на раннее функционирование желтого тела, что предположительно ведет к потерям на этапе имплантации эмбриона. Таким образом, поддержка ЛФ в программах ВРТ обязательна и имеет решающее значение, особенно в период времени между снижением уровня экзогенного человеческого хорионического гонадотропина (чХГ), назначаемого для финального созревания ооцитов, и повышением эндогенного чХГ на этапе имплантации.
Для восполнения недостаточности ЛФ используются различные режимы ее поддержки, включающие препараты прогестерона (Р), чХГ, эстрадиола (E2), аг-ГнРГ [4–7]. Однако в настоящее время нет идеального режима ведения ЛФ в стимулированных циклах. В последние годы появились исследования, в которых было отмечено существенное повышение частоты клинической беременности, частоты развивающейся беременности и частоты живорождения при добавлении препаратов аг-ГнРГ для поддержки ЛФ [8–11]. Положительные эффекты аг-ГнРГ для поддержки ЛФ циклов ВРТ отмечены в протоколах как с аг-ГнРГ, так и с ант-ГнРГ [4, 7, 12].
Механизм благоприятного влияния препаратов аг-ГнРГ в ЛФ стимулированного цикла не ясен и, в соответствии с представленными гипотезами, может реализовываться на различных уровнях. Согласно одной из гипотез, аг-ГнРГ осуществляет поддержку желтого тела через центральные механизмы, стимулируя секрецию ЛГ гонадотрофами гипофиза; согласно другой – воздействуя прямо на эндометрий через локальную экспрессию рецепторов ГнРГ [12]. Было также показано, что назначение аг-ГнРГ в ЛФ повышает частоту наступления беременности в циклах донации ооцитов у реципиентов с подавленной овуляцией и отсутствием желтого тела, что предполагает прямое влияние аг-ГнРГ на эмбрион [13].
Несмотря на обнадеживающие результаты использования препаратов аг-ГнРГ для поддержки ЛФ в ряде публикаций [5], недостатками этих работ являются гетерогенность выборок, различные режимы поддержки ЛФ в группе контроля, отсутствие ясности в механизме влияния этого режима поддержки ЛФ циклов ВРТ, что и послужило основанием для проведения настоящего исследования.
Цель исследования: оценить влияние комбинированного режима поддержки ЛФ препаратом аг-ГнРГ в сочетании с микронизированным Р на эффективность программ ЭКО.
Материал и методы исследования
Проведено рандомизированное контролируемое клиническое исследование у 207 пациенток с трубно-перитонеальным, мужским или сочетанным факторами бесплодия. Критериями включения в исследование были: возраст до 38 лет, уровень ФСГ <12 МЕ/л, регулярный менструальный цикл 21–35 дней, не более 2 безуспешных попыток ЭКО в анамнезе. Критерии исключения: наружный и внутренний эндометриоз III–IV степени распространения, интерстициальная или субсерозная миома матки размером более 4 см, пороки развития внутренних половых органов, включая состояния после хирургической коррекции, патозооспермия III–IV степени, развитие синдрома гиперстимуляции яичников средней или тяжелой степени на фоне стимуляции функции яичников в данном цикле ЭКО. Информированное согласие на участие в исследовании было получено у всех пациенток.
Стимуляцию функции яичников проводили по фиксированному протоколу с ант-ГнРГ с использованием препаратов рекомбинантного ФСГ со 2–3-го дня менструального цикла. Подбор стартовой дозы индуктора осуществляли исходя из параметров овариального резерва пациенток. Дозу индуктора корректировали в соответствии с ответом яичников на стимуляцию. В качестве триггера овуляции для финального созревания ооцитов назначали чХГ 10 000 МЕ. Трансвагинальную пункцию яичников (ТВП) осуществляли через 35 часов после введения триггера овуляции. Оценка качества полученных ооцитов по степени зрелости и эмбрионов осуществлялась на основании общепринятых критериев. Перенос 1–2 эмбрионов проводили на 3–5-е сутки культивирования. В зависимости от режима ведения ЛФ пациентки были рандомизированы на две группы: пациентки 1-й группы (n=92) получали натуральный микронизированный Р вагинально в дозе 600 мг/день с 1-х суток после ТВП (со следующего дня после ТВП) и однократную дозу трипторелина – 0,1 мг подкожно на 6-е сутки после оплодотворения; во 2-й группе (n=115) для поддержки ЛФ пациентки получали только натуральный микронизированный Р 600 мг в день вагинально с 1-х суток после ТВП.
Гормональный мониторинг ЛФ включал определение уровней ЛГ, Р, Е2 и β-ХГ на 5-й, 7-й и 15-й дни после оплодотворения. Концентрацию гормонов в сыворотке крови определяли с использованием иммуноферментных тест-систем фирмы «Hoffmann La Roche» на автоматическом анализаторе Elecsys 2010 этой же фирмы (Швейцария), а также хемилюминесцентных тест-систем фирмы DPC на автоматическом анализаторе Immulite (USA).
Эффективность лечения оценивали по показателям частоты наступления беременности на перенос эмбрионов. Биохимическая беременность была диагностирована на 15-й день после оплодотворения при концентрации β-субъединицы ХГ в сыворотке крови >20 МЕ/л. Имплантацию подтверждали при визуализации плодного яйца в полости матки по данным УЗИ. Клиническую беременность подтверждали при визуализации в полости матки одного или двух плодных яиц, содержащих живые эмбрионы через 5–6 недель после переноса. Прогрессирующей считалась беременность, продолжающаяся после 12 недель после переноса.
Статистическая обработка данных выполнена на персональном компьютере с использованием программы IPM SРSS Statistics, версия 21.
Все полученные количественные анамнестические, клинические, лабораторные и инструментальные данные обработаны методом вариационной статистики. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратичное отклонение (δ), ошибка среднего (m), медиана (Ме), 95% доверительный интервал, для качественных данных – частоты (%).
При нормальном характере распределения данных результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (М±m). При распределении данных, отличных от нормального (значение теста Колмогорова-Смирнова менее 0,05), исследованные количественные показатели представлены в виде Ме (L-H), где Ме-медиана, L-25 (нижний) квартиль, H – 75 (верхний) квартиль.
Для сравнения непараметрических данных применяли метод Манна-Уитни (для 2 групп) для несвязанных совокупностей; критерий χ2 для таблиц сопряженности признаков 2*2, 2*3 и 2*4 (для сравнения частот встречаемости признаков в анализируемых группах).
Статистически значимыми считали отличия при р<0,05 (95% уровень значимости).
Результаты исследования
Анализ клинико-лабораторных характеристик включенных в исследование пациенток обеих групп не выявил статистически значимых различий по возрасту (медиана составила 32 года, интерквартильный интервал 29–35 лет, р=0,749). Базальные уровни гормонов на 2–3-й день менструального цикла были сопоставимы в двух группах: ФСГ МЕ/Л (медиана 7,0 и 7,1 МЕ/Л, р=0,789), ЛГ МЕ/л (медиана 4,2 и 4,0 МЕ/л, р=0,309) и Е2 пмоль/л (медиана 104 и 89 пмоль/л, р=0,113). В 1-й группе отмечены более высокие концентрации АМГ (медиана 2,6 и 2,2 нг/мл), однако разница не была статистически значима (р=0,518). Бесплодие было обусловлено трубно-перитонеальным фактором у 33 (35,9%) пациенток в 1-й группе и у 41 (35,7%) во 2-й группе; р=0,974, мужским – у 41 (44,6%) и у 48 (41,7%); р=0,684, сочетание факторов наблюдалось у 18 (19,6%) и 25 (21,7%); р=0,576 женщин. Первичное и вторичное бесплодие в обеих группах встречалось с одинаковой частотой (р=0,486), длительность бесплодия в 1-й группе составила 5,5±0,4 года, во 2-й группе – 5,7±0,3 года (р=0,446).
Параметры стимулированного цикла и эмбриогенеза в обеих группах представлены в табл. 1.
Стартовая доза гонадотропина была сопоставима в обеих группах (223,6±6,7 и 220,0±6,1; р=0,386), также не отличалась суммарная доза гонадотропина и продолжительность стимуляции (1851,7±68,4 1982,0±65,3 р=0,166; 8,76±0,1 и 9,02±0,1; р=0,061).
Анализ эмбриологических параметров показал, что обе группы были сопоставимы по количеству полученных ооцитов (9,72±0,4 и 9,01±0,3; р=0,130), зрелых ооцитов (М11) (7,33±0,3 и 6,8±0,3; р=0,247) и зигот (2 PN) (7,3±0,3 и 6,8±0,3; р=0,814). Не наблюдалось различий в частоте дробления и развития эмбрионов до стадии бластоцисты. Не было выявлено различий по количеству полученных эмбрионов хорошего качества (1,7±0,1 и 1,47±0,1; р=0,062), перенесенных эмбрионов (1,8±0,03 и 1,8±0,03; р=0,967) и перенесенных эмбрионов хорошего качества (1,04±0,08 и 0,8±0,07; р=0,047).
Результаты гормональных параметров в динамике ЛФ представлены в табл. 2.
Как видно из представленных в таблице данных, на 5-й день после оплодотворения концентрации Р нмоль/л (медиана 346 и 300 нмоль/л, р=0,062), ЛГ МЕ/л (медиана 0,15 и 0,1 МЕ/л, р=0,081) и Е2 пмоль/л (медиана 5352 и 4945 пмоль/л, р=0,215) были сопоставимы между группами. На 7-й день после оплодотворения концентрации ЛГ МЕ/л (медиана 13,9 и 0,1 МЕ/л, р=0,0001), Р нмоль/л (медиана 335 и 170 нмоль/л, р=0,0001) и Е2 пмоль/л (медиана 5126 и 3501 пмоль/л, р=0,002) были достоверно выше в группе аг-ГнРГ. На 15-й день после оплодотворения уровни ЛГ (медиана 0,3 и 0,1 МЕ/л, р=0,003) и Р (медиана 206 и 108 нмоль/л, р=0,043) были существенно выше в группе аг-ГнРГ по сравнению с контрольной группой. В 1-й группе отмечены более высокие концентрации Е2 (медиана 2394 и 1402 пмоль/л), однако не было выявлено статистически значимой разницы (р=0,105).
Результаты параметров уровня β-ХГ у пациенток с наступившей беременностью в динамике ЛФ представлены в табл. 3.
Как видно из представленных в таблице данных, уровни β-ХГ на 5-й и 7-й дни после оплодотворения у пациенток с наступившей беременностью достоверно не различались между группами (р=0,662) и (р=0,673). Однако на 15-й день после оплодотворения уровень β-ХГ в группе пациенток использовавших комбинированный режим поддержки ЛФ был достоверно выше (р=0,0001).
Результаты гормональных параметров у пациенток с наступившей одноплодной и двухплодной беременностью в динамике ЛФ представлены в табл. 4.
Как видно из представленных в таблице данных, на 7-й день после оплодотворения у пациенток с одноплодной беременностью концентрации ЛГ (медиана 13,1 и 0,1 МЕ/л) и Р (317 и 146 нмоль/л) были существенно выше в группе аг-ГнРГ (р<0,05). Концентрации ЛГ при двухплодной беременности (медиана 17,3 и 0,1 МЕ/л) и Р (медиана 349 и 150 МЕ/л), также были выше в 1-й группе (р<0,05). Уровень Е2 на 7-й день после оплодотворения достоверно не отличался в обеих группах (р>0,05). На 15-й день после оплодотворения медиана ЛГ в 1-й группе у пациенток с двухплодной беременностью составила 0,3 МЕ/л (интерквартильный интервал 0,2–0,5 МЕ/л), что было достоверно выше, чем во 2-й группе (медиана 0,1 МЕ/л (интерквартильный интервал 0,1–0,2), р<0,05). Концентрации Р и Е2 не имели статистически значимых отличий в обеих группах (р>0,05). Медианы уровней β-ХГ на 15-й день после оплодотворения у пациенток в 1-й группе с одноплодной и двухплодной беременностью составили 220 Ме/л (интерквартильный интервал 159–2267 Ме/л) и 453 Ме/л (378–490), что было существенно выше (р<0,05), чем у пациенток во 2-й группе (медиана 112 Ме/л (интерквартильный интервал 110–118 Ме/л) и 244 Ме/л (127–276,5) (табл. 5).
Как видно из представленных в таблице данных, частота биохимической беременности в 1-й группе составила 51,1%, что было существенно выше, чем в группе сравнения 34,8% (р=0,018). Частота имплантации была достоверна выше в группе пациенток, которым для поддержки ЛФ добавляли аг-ГнРГ – 30,6% против 16,6% (р<0,05). Частота клинической беременности также была достоверно выше в группе аг-ГнРГ – 40,2 и 27% (р=0,044). Частота прогрессирующей беременности была выше в группе пациенток использовавших комбинированный режим поддержки ЛФ (37 и 21%), но разница не была статистически значима (р=0,349). Была отмечена более низкая частота прерывания беременности в 1-й группе (8,1 и 22,5%), однако не было выявлено статистически значимых отличий (р=0,309). Частота наступления многоплодной беременности была существенно выше в 1-й группе (35,1 и 12,9%, р=0,049).
Обсуждение
Данное рандомизированное контролируемое клиническое исследование было проведено в протоколе с ант-ГнРГ с целью оценки влияния комбинированного режима поддержки ЛФ (аг-ГнРГ+микронизированный Р) по сравнению со стандартным режимом на эффективность программы ЭКО. Проведенный анализ показал, что частота наступления биохимической беременности (51,1 и 34,8%), имплантации (30,6 и 16,6%) и клинической беременности (40,2 и 27%) была достоверно выше в группе аг-ГнРГ (р=0,018, р<0,05 и р=0,044), чем в контрольной группе. В исследовании Tesařík (2006) частота прогрессирующей беременности была достоверно выше в группе пациенток, которые получали для поддержки ЛФ аг-ГнРГ по сравнению с группой контроля; в нашем исследовании также было отмечено увеличение частоты прогрессирующей беременности в группе аг-ГнРГ (37 против 21%), однако полученные результаты не имели статистически значимой разницы (р=0,349) [4]. Возможное влияние препаратов аг-ГнРГ на прерывание беременности обсуждалось в ряде работ Fuji и соавт. (2001), H. Qublan и соавт. (2008), D.B. Inamdar, A. Majumdar (2012), однако полученные результаты эти предположения не подтвердили [8, 10, 14]. В данном исследовании частота прерывания беременности в группе аг-ГнРГ была ниже, чем в контрольной группе (8,1 и 22,5%), однако не было выявлено статистически значимых различий между группами (р=0,309). Тем самым было показано, что добавление аг-ГнРГ в ЛФ не влияло на частоту ранних репродуктивных потерь. Влияние аг-ГнРГ на увеличение частоты наступления многоплодной беременности было отмечено в нескольких исследованиях Tesarik и соавт. (2006), A.Z. Isik и соавт. (2009), Fuji и соавт. (2001) [4, 8, 9]. В данном исследовании также было отмечено значительное увеличение частоты многоплодной беременности в группе аг-ГнРГ – 35,1 против 12,9% (р=0,049).
До конца не ясен механизм, лежащий в основе предлагаемого благоприятного действия аг-ГнРГ в ЛФ; существуют предположения, что он может воздействовать на эмбрион, эндометрий и/или на желтое тело. Предположение о возможности прямого действия аг-ГнРГ на эмбрион обсуждалось в ряде работ. Результаты экспериментальных исследований на животных показали, что аг-ГнРГ могут улучшить развитие эмбриона in vitro и благоприятно влияют на уровни имплантации [15–18]. В исследовании P.A.B. Klemmt (2009) было показано, что аг-ГнРГ являются потенциальными промоутерами развития эмбрионов и имплантации [19]. В работе Tesarik и соавт. (2004) было показано, что назначение аг-ГнРГ для поддержки ЛФ повышает частоту наступления беременности в циклах донации ооцитов у реципиентов с подавленной овуляцией и отсутствием желтого тела, что предполагает прямое влияние аг-ГнРГ на эмбрион [13]. Гипотеза о возможном прямом действии аг-ГнРГ на эмбрион подтверждается и в другом исследовании Tesarik и соавт. (2006), в котором было отмечено, что пациентки с наступившей беременностью в группе аг-ГнРГ имели более высокую концентрацию β-ХГ на 15-й день после оплодотворения [4]. По результатам настоящего исследования было отмечено существенное увеличение частоты имплантации в группе аг-ГнРГ (р<0,05), а также увеличение концентрации β-ХГ на 15-й день после оплодотворения, у пациенток 1-й группы (медиана 235 и 115 Ме/л, р=0,0001), что может свидетельствовать о влиянии аг-ГнРГ на эмбрион. Ранее сообщалось, что ГнРГ повышает уровень чХГ в сыворотке крови у беременных женщин (Iwashita и соавт., 1993), по-видимому, воздействуя на рецепторы ГнРГ плаценты (Lin и соавт., 1995) [20, 21]. Кроме того, в работе T.M. Siler-Khodr (1997) было установлено, что антитела к ГнРГ присутствовали в крови беременных женщин с предшествующими выкидышами и низким уровнем чХГ, что подтверждает важную роль ГнРГ в имплантации и плацентации [22].
Тем не менее, данные говорящие в пользу прямого действия аг-ГнРГ на эмбрион не исключают другие механизмы, действующие, возможно, параллельно. Вопрос о возможном механизме действия аг-ГнРГ на желтое тело обсуждался в нескольких роботах [4, 12]. В исследовании Pirard и соавт. (2005) было показано, что низкие дозы аг-ГнРГ (100 мкг бусерелина) способны оказывать стимулирующее действие на желтое тело [12]. В другом исследовании Tesarik и соавт. (2006) было отмечено увеличение Р и Е2, однако не удалось обнаружить заметного увеличения в сыворотке крови концентрации ЛГ на следующий день после введения аг-ГнРГ, что не указывает на роль гипофиза в механизме действия аг-ГнРГ [4]. Однако необходимо учитывать тот факт, что для получения этого эффекта достаточно даже короткого пика ЛГ, который мог не быть зарегистрирован с учетом дизайна исследования [4].
Напротив, в проведенном нами исследовании было зафиксировано достоверное увеличение ЛГ (р=0,0001), на 7-й день после оплодотворения в группе аг-ГнРГ, что может свидетельствовать в пользу того, что аг-ГнРГ осуществляет поддержку желтого тела через центральные механизмы, стимулируя секрецию ЛГ гонадотрофами гипофиза. Кроме того, было выявлено увеличение Р и Е2 в группе аг-ГнРГ, что также поддерживает теорию о действии аг-ГнРГ на желтое тело.
В работе H. Qublan (2008) было выявлено благоприятное влияние аг-ГнРГ на эндометрий, которое можно объяснить тем, что ГнРГ и его рецепторы присутствуют в эндометрии женщин на протяжении всего менструального цикла, в эпителиальных и стромальных клетках с повышением экспрессии рецепторов ГнРГ в децидуализированных стромальных клетках в ЛФ [10, 23].
Локальная экспрессия ГнРГ трофобластом и присутствие его рецепторов в децидуализированном эндометрии предположительно может играть важную роль в диалоге между бластоцистой и эндометрием на стадии ранней имплантации, путем модуляции баланса между матриксными металлопротеиназами и их ингибиторами [24, 25]. Благодаря специфическому ингибированию тканевых ингибиторов металлопротеиназ повышается инвазивная способность трофобласта, что способствует более успешной имплантации бластоцисты. Тем не менее, in vitro не удалось выявить существенного влияния аг-ГнРГ на степень децидуализации эндометриальных стромальных клеток (P.A. Klemmt, 2009) и на экспрессию генов эпителиальных клеток эндометрия человека (X. Zhang, 2010) [19, 26]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить возможное прямое воздействие аг-ГнРГ на эндометрий.
Заключение
Таким образом, добавление препаратов аг-ГнРГ для поддержки ЛФ оказывает благоприятный эффект на исходы программы ЭКО, увеличивая частоту наступления беременности. Наблюдаемое увеличение частоты имплантации у пациенток, получавших аг-ГнРГ для поддержки ЛФ, по сравнению с группой контроля, указывает на повышенный риск многоплодной беременности. Это свидетельствует о необходимости совмещения поддержки ЛФ аг-ГнРГ с переносом одного эмбриона.
