Частота оппортунистических инфекций влагалища имеет тенденцию к росту, несмотря на все расширяющийся арсенал применяемых в клинической практике антимикробных средств [2]. Механизмы развития этой патологии до настоящего времени остаются нераскрытыми. Расшифровать их невозможно без детального изучения связей макроорганизма и микробиоты влагалища здоровых женщин. Представление о Lactobacillus acidophilus как о практически единственном представителе нормальной микрофлоры влагалища со времен Дедерлейна непоколебимо просуществовало почти столетие. Только с внедрением молекулярно-генетических методов исследования появилась возможность на новом методическом уровне изучать композиционные особенности состава микробиоты влагалища, которая играет важную роль в колонизационной резистентности этого органа как защитного барьера репродуктивной системы в целом [3, 4, 8]. Первые исследования показали значительное видовое разнообразие лактофлоры и отличия ее в разных этнических группах женщин и в различных регионах мира, что, по-видимому, является генетически обусловленным [3, 6]. Такие исследования могут стать базой для новых терапевтических стратегий в лечении влагалищных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, а также основой для отбора штаммов при создании биопрепаратов.
В России не было систематических исследований по видовой идентификации влагалищных
лактобацилл у женщин различных возрастных групп и при различном состоянии микроценоза
(микробиоты) влагалища. Проблема внутривидового (штаммового) разнообразия лактобацилл
также практически не изучена ни в России, ни в других странах.
Целью настоящего исследования было определить видовой состав лактобацилл у женщин
репродуктивного возраста при различном состоянии микробиоты влагалища: при нормоценозе,
промежуточной форме (мезоценозе) и бактериальном вагинозе.
Материал и методы исследования
Изучено 386 изолятов лактобацилл, полученных из отделяемого влагалища 30 небеременных
женщин репродуктивного возраста. Были сформированы 3 группы по 10 женщин в зависимости
от результатов микробиологической диагностики состояния микробиоты влагалища: «нормоценоз», «бактериальный вагиноз» и «мезоценоз». Оценку состояния микроценоза влагалища проводили на основе критериев R.P. Nugent [7], модифицированных нами [1].
Посев отделяемого влагалища (образец), взятого стерильным дакроновым тампоном, проводили на чашку Петри с плотной селективной минерально-растительной средой (МРС). Посевы культивировали в течение 48 ч в микроаэрофильных условиях при температуре 37 ˚С. Из каждого образца отбирали по 10–15 колоний (изолятов), по возможности, разной морфологии, которые по предварительным тестам (рост на селективной среде, грамположительные каталазоотрицательные палочки) были отнесены к роду Lаctobacillus. Каждый изолят рассевали петлей методом истощения до получения морфологически однородных отдельных колоний (морфологию колоний контролировали с использованием бинокулярного стереомикроскопа) и отсевали в жидкую среду МРС для накопления биомассы.
Видовую идентификацию всех 386 клинических изолятов проводили по белковому спектру методом MALDI TOF масс-спектрометрии, используя масс-спектрометр Microflex и программный продукт MALDI Biotyper 2.0 фирмы Bruker Daltonics (Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Все изоляты были дифференцированы по такому клинически важному признаку, как способность образовывать перекись водорода. Для этого колонии лактобактерий рассевали петлей на чашки, содержащие пероксидазу хрена и тетраметилбензидин [5] (в нашем случае диаминобензидин). Чашки инкубировали при 37 °С в микроаэрофильных условиях 24 ч. Продуцирующие перекись водорода колонии окрашивались в коричневый цвет, так как пероксидаза хрена в питательной среде окисляет диаминобензидин в присутствии перекиси водорода [5]. Для определения возможной штаммовой гетерогенности изолятов, выделенных от одной и разных женщин, был использован метод REP-ПЦР типирования [4].
Результаты исследования
Результаты видовой идентификации 386 первичных изолятов лактобацилл, полученных от женщин трех групп, представлены в табл. 1.
Таблица 1. Видовая идентификация лактобацилл, выделенных у наблюдаемых женщин.
Как следует из табл. 1, только 7 (1,8 %) изолятов из 386 не могли быть идентифицированы до вида с помощью системы MALDI Biotyper 2.0. У обследованных женщин было выделено 6 видов рода Lactobacillus со значительным превалированием трех видов (L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri), которые составили в сумме 94,7% от всех идентифицированных изолятов. Большинство изолятов прошли идентификацию с высокой степенью достоверности (score>2,0). Исключение составили изоляты вида L. jensenii, которые более чем в половине случаев (75 из 130) – 57,7 % показали видовую идентификацию с низкими показателями score (>1,7–<2,0). Возможно, это связано с тем, что в базе данных MALDI Biotyper 2.0 на данный момент содержится лишь ограниченное число штаммов этого вида, и такой результат в нашем исследовании можно объяснить естественным внутривидовым разнообразием лактобацилл.
Связь видового состава лактобацилл с различными состояниями микробиоты влагалища представлена в табл. 2.
Таблица 2. Видовой состав лактобацилл при различном состоянии микробиоты влагалища.
Как видно из табл. 2, при нормоценозе у обследованных женщин выделены лактобациллы только трех видов: ведущим был вид L. crispatus, составивший 59,3% среди выделенных изолятов, виды L. jensenii и L. gasseriбыли выделены из 22,0 и 18,7% изолятов соответственно. При этом обращало на себя внимание, что у каждой из 10 женщин с нормоценозом все выделенные изоляты были представлены только одним видом лактобацилл.
При бактериальном вагинозе те же три вида лактобацилл практически встречались с равной частотой (примерно по 30 % изолятов каждого вида). Kроме того, 15 (11,8%) изолятов были идентифицированы как L. acidophilus (все выделены у одной женщины). Только у одной пациентки с бактериальным вагинозом было 2 вида лактобацилл, у остальных 9 – все изученные изоляты принадлежали к какому-либо одному виду лактобацилл.
При мезоценозе 53,6% изолятов идентифицированы как L. jensenii. Виды L. gasseri и L. crispatus составили 27,1 и 17,8% соответственно. На долю других видов (L. salivarius и L. johnsonii) пришлось только 5 изолятов, которые были выделены у двух женщин в комбинации с ведущими видами лактобацилл. У 7 женщин присутствовал лишь один вид лактобацилл, у двух – по два вида и у одной женщины среди 15 изолятов было 3 вида лактобацилл. Таким образом, как при нормоценозе, так и при мезоценозе и бактериальном вагинозе, у подавляющего большинства обследованных женщин изоляты лактобацилл были представлены каким-либо одним видом.
У всех изолятов была проверена способность к продукции перекиси водорода, как одного из ведущих защитных свойств индигенной микрофлоры. Полученные результаты редставлены
в табл. 3.
Таблица 3. Продукция перекиси водорода у изолятов различных видов лактобацилл в зависимости от состояния микробиоты влагалища.
Как видно из табл. 3, при нормоценозе подавляющее большинство изолятов (96,7%) продуцировали
перекись водорода, при мезоценозе – 30% изолятов теряли такую способность, а при бактериальном вагинозе почти половина изолятов лактобацилл не продуцировали перекись водорода.
Можно отметить, что изоляты L. crispatus чаще сохраняли способность к продукции перекиси водорода (даже при бактериальном вагинозе) по сравнению с другими видами лактобацилл.
Обращало на себя внимание, что только у одной женщины способность к синтезу перекиси водорода отсутствовала у всех изолятов одного вида. Чаще изоляты, различающиеся по данному признаку, присутствовали одновременно в различных соотношениях. Так как в анализ попала небольшая выборка от каждой женщины, трудно судить о клиническом значении полученных данных. Тенденция к увеличению числа лактобацилл, не продуцирующих перекись водорода, более четко выявлялась при патологическом состоянии микрофлоры влагалища. При бактериальном вагинозе у 7 из 10 женщин были выявлены варианты лактобацилл, не продуцирующие перекись водорода, при мезоценозе – у 3 из 10, тогда как при нормоценозе – только у 1 из 10.
Для определения идентичности или различий изолятов лактобацилл одного вида, выделенных у одной
пациентки или от разных женщин, было проведено типирование ряда изолятов с помощью геномного
ПЦР-фингерпринта методом RЕР-ПЦР. Показано, что изоляты, выделенные от одной пациентки и принадлежащие к одному виду, не отличались по паттернам полос (рис. 1, см. на вклейке).
Это свидетельствует о генетической однородности изолятов и, следовательно, принадлежности их к
одному штамму. Но при этом имела место разная способность изолятов образовывать перекись водорода. В то же время изоляты одного вида лактобацилл, выделенные от разных женщин, как правило, отличались по ПЦР-паттернам, что позволяет относить их к разным штаммам (рис. 2, см. на вклейке).
Обсуждение
Использование новой технологии – масс-спектрометрического анализа белковых молекул для
видовой идентификации микроорганизмов – позволило идентифицировать в составе влагалищной микробиоты женщин репродуктивного возраста несколько видов лактобацилл. Однако три вида ( L. crispatus, L. gasseri и L. jensenii ) были абсолютно доминирующими (93,0%) среди микроаэрофильных лактобацилл независимо от состояния микробиоты влагалища (нормоценоз, мезоценоз или бактериальный вагиноз). В данном исследовании нас интересовало, имеет ли место видовое разнообразие лактобацилл при различном микробиологическом диагнозе. Поэтому мы не учитывали количественные характеристики видовых популяций лактобактерий и у всех наблюдаемых женщин отбирали одинаковое число первичных изолятов лактобацилл (10–15). Изучение 386 изолятов от 30 женщин показало, что индивидуальные популяции лактобацилл у большинства женщин гомогенны по видовому составу, реже содержат два (еще реже три) различных вида лактобацилл.
Исследование внутривидовой гетерогенности индивидуальных популяций лактобацилл мы проводили с помощью RЕР-ПЦР. Однако разрешающая способность RЕР-ПЦР не позволяет различать близкородственные штаммы, которые могут отличаться некоторыми экологически существенными признаками. К сожалению, наши попытки создать более высокоразрешающую систему, пригодную для высокопроизводительного типирования лактобацилл, пока не увенчались успехом. Тем не менее полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения о клональной гомогенности большинства индивидуальных популяций. В то же время фингерпринты лактобацилл, выделенных от разных женщин, достоверно различались. Эти результаты позволяют предположить, что популяции вагинальных лактобацилл не подвергаются продолжительному воздействию штамм-специфичных
селективных факторов, зависящих от плотности популяции (таких, как фаговая инфекция). В то же
время имеется тенденция к уменьшению гомогенности лактобацил при мезоценозе, что может быть
вызвано действием неидентифицированных факторов, влияющих на различные штаммы с различной
интенсивностью.
Изоляты, выделенные от одной женщины и идентичные по паттернам RЕР-ПЦР (то есть принадлежащие к одному штамму), в ряде случаев различались по признаку продукции перекиси водорода. Это свидетельствует о возможном эпигеномном наследовании данного признака (как стабильного физиологического состояния). Возможно также, что утрата или приобретение способности к продукции перекиси водорода связана с точечными мутациями, не выявляемыми ПЦР-фингерпринтом. Вопросы о механизмах генетической детерминации и регуляции продукции перекиси водорода у лактобацилл, а также возможности и частоты изменения этого признака in situ практически не изучены и требуют дополнительного исследования.
Обнаружение нами факта гомогенности большинства индивидуальных популяций лактобацилл вызывает вопрос о стабильности ассоциации макроорганизма и доминирующего штамма этих бактерий. Возможно, колонизация влагалища у определенной женщины именно этим штаммом лактобацилл является не случайной, а отражает взаимное соответствие особенностей организма-хозяина и свойств микроорганизма. Например, степень выраженности адгезии лактобацилл к эпителию влагалища может зависеть от индивидуальных различий поверхностных белков эпителиальных клеток и штаммовых различий бактерий по набору и экспрессии адгезинов. В таком случае это явление следует учитывать при создании вагинальных пробиотиков. Возможно, окажется целесообразным проводить индивидуальный подбор пробиотического штамма с целью достижения наиболее эффективной и стойкой колонизации влагалища.
Работа поддержана грантами ГК № 02.740.11.0313с Минобрнауки, РФФИ № 09-04-01482-а и программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине».
