Итоги проекта «Микробиом человека» («The Human Microbiom Project»), проведенного в 2007–2016 гг., позволяют судить о том, что микробиота оказывает значительное влияние на состояние здоровья. В настоящее время геном человеческого тела рассматривается в совокупности с геномом всех микроорганизмов, его населяющих (голобионт). Понятие «здоровая микробиота» постоянно обновляется. В настоящее время этот термин подразумевает микробиоту биотопов человека, обладающую способностью к динамическому равновесию, или «динамическому здоровью» [1–4].
На протяжении многих лет репродуктивное здоровье женщин рассматривается в аспекте состояния вагинальной микробиоты [1, 2]. С учетом анатомических, физиологических и поведенческих особенностей женщин, биотопу влагалища присущи высокие риски инвазии патогенов. Микробиота женского урогенитального тракта при кажущейся простоте достаточно сложна. Несмотря на ежедневное воздействие мочи и экскретов желез, а также близко расположенного резервуара кишечных микроорганизмов (прямая кишка), микробиота вагинального биотопа остается относительно стабильной; количество постоянно присутствующих микроорганизмов составляет в среднем не более 10 различных видов. Сложность связана с варьированием количественных и качественных параметров в зависимости от фазы менструального цикла, возраста и различных внешних факторов. Таксономическое разнообразие микроорганизмов велико – от бактерий и простейших до грибов и вирусов.
Слизистая влагалища имеет многослойную структуру, представленную плоским эпителием, и периодически обновляется (в среднем за 4–5 суток). Микробиота также постоянно претерпевает структурные преобразования.
Способность некоторых микроорганизмов (хламидии, вирусы) к внутриклеточному персистированию определяет необходимость использования для их детекции молекулярно-биологических методов. Однако для получения исчерпывающей информации о составе микробиоты молекулярно-биологические методы исследования микробиоты целесообразно использовать в комплексе с классическими культуральными методами. Выделение чистой культуры микроорганизмов необходимо для изучения фенотипических и молекулярно-биологических характеристик представителей микрофлоры человека с целью успешного поиска микроорганизмов – кандидатов в пробиотики, определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и дезинфектантам, проведения эпидемиологических расследований.
Классификация микробиоты влагалища
Вагинальная микробиота – это сложная и динамичная экосистема, которая постоянно подвергается колебаниям в течение женского менструального цикла и всей жизни женщины. Общее количество микроорганизмов в вагинальном отделяемом здоровой женщины репродуктивного возраста составляет 6–8 КОЕ/мл и представлено разнообразными видами. Основную часть микробиоты влагалища женщин репродуктивного возраста (от 60 до 90%) составляют Lactobacillus spp. Кроме лактобацилл в состав микробиоты репродуктивного тракта могут входить Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Listeria spp., Neisseria spp., Gardnerella spp., Enterobacterales spp., Acinetobacter spp., Ureaplasma spp., Peptostreptococcus spp., Actinomyces spp., Bifidobacterium spp., Propionibacterium spp., Clostridium spp., Veillonellae spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Mobiluncus spp., Candida spp.
Вагинальная микробиота в значительной степени отличается у разных женщин, и различия могут быть обусловлены вариациями сексуальной активности [5], особенностями личной гигиены [6], психоэмоциональным статусом [7], климатогеографической [8] и расовой принадлежностью [1], а также другими факторами. Ранняя классификация по степени чистоты и типам биоценоза основывается на методах традиционной световой микроскопии и классической микробиологии. В данных классификациях учитывается выраженность лейкоцитарной реакции (количество лейкоцитов в поле зрения), характер эпителиальных клеток (поверхностный, промежуточный, парабазальный, базальный, цитолиз), морфология микроорганизмов, качественный и количественный состав микробиоты. Расширение представлений о составе микробиоты с помощью молекулярно-биологических методов исследования (секвенирование по Сэнгеру, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, различные варианты метагеномного секвенирования) позволило типировать микробиоту влагалища в зависимости от соотношения бактериальных составляющих.
По результатам проекта «Микробиом человека», при проведении которого использовалось секвенирование бактериальной 16s рРНК, сделан вывод о том, что микробиота влагалища подразделяется на 5 типов (CST – type of community status – тип состояния сообщества). Согласно данной классификации, в CST I, II, III и V доминируют L. crispatus, L. gasseri, L. iners и L. jensenii соответственно; тогда как CST IV присуще высокое разнообразие микробного сообщества, характеризующееся наличием облигатных анаэробных бактерий. CST I, II, III и V присущи 89,7% белых женщин и 80,2% азиатских женщин, в меньшей степени – чернокожим и испаноязычным женщинам (61,9 и 59,6% соответственно) [9]. Однако последние исследования по изучению микробиоты женского репродуктивного тракта с помощью полногеномного высокопроизводительного секвенирования нового поколения позволяют предполагать, что данная классификация по типам характерна не для всех региональных и социально-культурных групп. Так, проведенное продольное исследование здоровых датских женщин репродуктивного возраста показало отсутствие CST II (с преобладанием L. gasseri) и CST V (с преобладанием L. jensenii) в исследуемой группе [10]. Таким образом, в настоящее время нет устойчивой общепринятой классификации микробиоты влагалища, и данный вопрос требует дальнейшего изучения.
Роль Lactobacillus в микробиоте влагалища женщин репродуктивного возраста
Критериями, которые позволяют отнести микроорганизм к облигатной (резидентной) микробиоте, являются встречаемость почти у 100% популяции женщин и отсутствие факторов патогенности. Таким условиям удовлетворяют Lactobacillus spp.
Род Lactobacillus превалирует в микробиоте влагалища, и его представители продуцируют различные антимикробные соединения, такие как молочная кислота, перекись водорода и бактериоцины, тем самым способствуя оптимальному состоянию и определяя колонизационную резистентность биотопа. Виды Lactobacillus являются основными продуцентами L- и D-изомеров молочной кислоты, поддерживающей значение рН среды биотопа ниже 4,5 [11, 12]; тогда как эпителиальные клетки слизистой влагалища продуцируют лишь около 20% L-изомера молочной кислоты [13].
Значение перекиси водорода (H2O2), продуцируемой лактобациллами вагинальной микробиоты, продолжает изучаться. Некоторые исследования показали, что H2O2 оказывает положительное влияние на ингибирование чрезмерного роста патогенных микробов [14, 15]. O'Hanlon D.E. еt al. опубликовали данные о том, что H2О2 при физиологических уровнях продукции не обладает бактерицидным действием на патогенные микроорганизмы, тогда как при высоких концентрациях проявляет большую антимикробную активность в отношении Lactobacillus spp. [16].
Lactobacillus также синтезируют бактериоцины – тип антимикробных пептидов, которые могут разрушать клеточную мембрану неиндигенных микроорганизмов [17]. Кроме того, Lactobacillus адгезируются на эпителиальных клетках влагалища и конкурируют с другими микробными клетками за сайты связывания [18]. Этот вывод важен, поскольку адгезия патогена к эпителиальным клеткам является первым шагом формирования биопленки как предпосылки инфекционного процесса [19, 20]. Примечательно, что доминирующие виды лактобацилл определяют степень защиты влагалищной экосистемы. Считается, что дисбиотические нарушения и низкая стабильность микробиоты обычно связаны с доминированием вида L. iners. Напротив, оптимальное состояние и стабильность вагинальной микробиоты усиливаются видом L. crispatus, который обеспечивает необходимый уровень D- и L-изомеров молочной кислоты [21].
Факторы, влияющие на состояние микробиоты влагалища
В экосистеме «человек–микроорганизмы» существует обратная гомеостатическая и мутуалистическая связь между микробиотой и ее хозяином. Хозяин обеспечивает оптимальные условия для обитания микроорганизма (влажность, питательный субстрат, температурный режим), а резидентная микробиота – колонизационную резистентность за счет выработки антимикробных и противовоспалительных факторов. Этот баланс динамически не стабилен и может быть нарушен внутренними или внешними факторами. К внутренним факторам относят гормональный статус [22], возраст [23] и состояние иммунной системы [24]. Внешние воздействия, такие как антибиотики [25], инфекции, передаваемые половым путем, и воздействие микрофлоры, привносимой извне (смена половых партнеров), также влияют на состав микробиоты и являются потенциальными факторами риска заболеваний. Снижение разнообразия микрофлоры в кишечной экосистеме связано с заболеваниями как воспалительного (колиты), так и общего характера, связанного с нарушением обменных процессов [26]. В то же время выраженное разнообразие во влагалищной экосистеме является предиктором патологических процессов. Например, у женщин репродуктивного возраста – это бактериальный вагиноз (БВ) [27–29].
Отличительные особенности L. iners
Основным оценочным критерием трансформации здоровой вагинальной микробиоты в патологическую является видовой и количественный состав лактобацилл. Влагалище одновременно могут колонизировать до пяти видов лактобацилл, но доминирует один [30]. L. сrispatus доминирует у женщин с долей лактобацилл в микробиоте влагалища 80% и более. L. jensenii и L. gasseri доминируют у женщин с долей лактобацилл от 20 до 80% (данные варианты рассматриваются как умеренный дисбиоз). L. iners как доминирующий вид выделяется при любых вариантах микробиоценоза, но по мере снижения общей доли нормофлоры в микробиоте увеличивается частота его обнаружения как единственного вида лактобацилл. При доле лактобацилл менее 20% (выраженном дисбиозе) L. iners, как правило, остается единственным определяемым видом [31].
L. iners впервые выделена из влагалищного биотопа в 1999 г. Это трудно культивируемый микроорганизм, и на селективном агаре для лактобацилл (МRS-агаре) не растет. Для его выделения используют среды с добавлением 5% крови и культивирование в микроаэрофильных или анаэробных условиях [30, 31]. Колонии, выросшие через 24 ч инкубации, – мелкие, гладкие, круглые, полупрозрачные, непигментированные.
Ранее L. iners характеризовали как грамположительную, факультативно-анаэробную палочку [32]. Затем появились сообщения о том, что, в отличие от других видов лактобацилл, L. iners грамвариабельна и имеет коккобациллярную, а не бациллярную морфологию [33]. Действительно, морфология этого вида может варьировать от длинной вытянутой палочки до коккобациллы. Японские ученые опубликовали сообщение том, что L. iners визуализируется как грамотрицательная короткая палочка и обладает слабой кислотоустойчивостью, поскольку теряет жизнеспособность в среде с уровнем pH=3 [34]. Эта особенность объясняет причину ошибочных заключений об отсутствии лактобацилл в исследуемой микробиоте при проведении классических культуральных исследований и микроскопии. С помощью просвечивающей электронной микроскопии показано, что слой пептидогликана в клеточной стенке L. iners тонкий, не прокрашивается анилиновым красителем (генциан виолет), и, фактически являясь грамположительной, эта лактобацилла субъективно воспринимается как грамотрицательная [35].
Морфологию и тинкториальные свойства L. iners необходимо учитывать, поскольку широко используемая шкала Nugent, включающая оценку окраски по Граму вагинальных мазков, остается распространенным диагностическим инструментом при оценке вагинальной микробиоты. Полиморфность, а также способность к плотной адгезии на эпителиоцитах («ложноключевые клетки») «маскируют» факт наличия у пациенток лактобацилл при микроскопии, что может привести к ошибочному диагнозу БВ, для которого характерно истощение видов Lactobacillus [36]. Это может объяснить, почему до 50% женщин с диагнозом БВ, поставленным по результату микроскопии, не имеют характерных симптомов заболевания [37].
Идентификация L. iners осуществляется с помощью молекулярно-биологических методов. До настоящего времени не определена функция этого вида лактобацилл в микробиоте влагалища. В отличие от других видов лактобацилл этот вид продуцирует инеролизин – холестеринзависимый цитолизин, то есть обладает фактором патогенности. Инеролизин по аминокислотной последовательности на 68% идентичен ваголизину Gardnerella vaginalis, однако между этими токсинами имеются принципиальные различия. Инеролизин теряет свою активность в щелочной среде, а ваголизин – в кислой. Уровень активности в отношении клеточных мембран у инеролизина не зависит от содержания в ней холестерина, а ваголизин активен в отношении клеточных мембран, богатых холестерином. Кроме того, инеролизин активен в отношении как прокариотических, так и эукариотических клеток [38].
В отличие от других видов Lactobacillus, L. iners не может генерировать D-изомер молочной кислоты, который играет более важную роль в создании оптимального уровня рН влагалища, чем L-изомер [39]. Наличие в микробиоте влагалища L. iners, являющейся, по современным представлениям, одной из самых часто встречающихся лактобацилл, не может однозначно указывать на неблагоприятные прогнозы для здоровья пациенток. Неизвестно, различаются ли культуральные свойства и генетическая структура штаммов, выделяемых у пациентов с нормоценозом и дисбиотическим состоянием микробиоты влагалища.
По данным разных исследований, L. iners выделяется у женщин репродуктивного возраста с частотой от 17 до 58,3% [40] и является вторым доминирующим видом после L. сrispatus [10]. Способность данного вида доминировать при нормоценозе и сохраняться при дисбиотических состояниях с повышенным уровнем рН может свидетельствовать о высоком адаптивном потенциале L. iners и способности обеспечить реколонизацию влагалища другими видами лактобацилл после устранения инициирующего фактора дисбиоза [41]. Описаны результаты исследования, доказывающие ингибирующую роль в отношении L. iners бактериоцинов, вырабатываемых L. paragasseri (штамм К7), и высказаны предложения о целесообразности разработки препаратов на основе штамма К7 с целью элиминации L. iners из микробиоты влагалища [42]. Но единого мнения о роли этого вида лактобацилл до сих пор нет.
Особенности микробиоты влагалища при бактериальном вагинозе
Описанный как неспецифический вагинит [43], БВ характеризуется изменением состава вагинальной микрофлоры с резким истощением пула Lactobacillus из-за значительного избыточного роста облигатных или факультативных анаэробов, которые ранее составляли незначительную часть биотопа влагалища. Истинная этиология БВ, несмотря на многочисленные работы, до сих пор неизвестна. БВ влияет на неблагоприятные исходы беременности, сопряжен с инфицированием вирусом иммунодефицита человека, вирусом папилломы человека и воспалительными заболеваниями органов малого таза. БВ широко распространен среди женщин репродуктивного возраста во всем мире.
БВ диагностируют у 23–29% женщин репродуктивного возраста ежегодно, и на симптоматическое лечение БВ ежегодно тратится 4,8 млрд долларов во всем мире. Для микробиоты влагалища при БВ характерны элиминация или резкое снижение общего количества лактобацилл и 100–1000-кратное увеличение концентрации факультативных или облигатных анаэробных бактерий, таких как Gardnerella, Prevotella, Atopobium, Mobiluncus, Bifidobacterium, Sneathia, Leptotrichia. Серьезной проблемой является хроническое течение БВ с множественными рецидивами. Стандартная антибактериальная терапия метронидазолом или клиндамицином часто неэффективна; при этом частота рецидивов в первые полгода после лечения составляет 50% [44–47].
Высокое разнообразие вагинальной микрофлоры у больных с БВ описано еще в 1921 г.; а в 1955 г. Герман Гарднер открыл Haemophilus vaginalis – грамотрицательную палочку и представил ее как этиологический агент неспецифического бактериального вагинита [46]. Позже она была переименована в Gardnerella vaginalis.
Клетки G. vaginalis грамвариабельны, плеоморфны и неподвижны. Вид не обладает оксидазной и каталазной активностью. На агаре с добавлением 5% бараньей крови образует небольшие круглые полупрозрачные (иногда сероватые) колонии, без зоны гемолиза вокруг. Оптимальные условия культивирования анаэробные, но некоторые штаммы способны расти в микроаэрофильных условиях.
G. vaginalis продуцирует порообразующий токсин ваголизин, протеолитические ферменты, способные расщеплять белки и декарбоксилазы, отщепляющие карбоксильную группу аминокислот с выделением аминов во влагалищный секрет. Соединения аминов придают влагалищному секрету неприятный рыбный запах, который используется в качестве одного из лабораторных тестов на БВ – «аминный тест». Впоследствии органические кислоты и бактериальные полиамины оказывают цитотоксическое действие, и, как следствие, происходит массовая десквамация эпителия, обуславливающая появление выделений из влагалища. Кроме того, данный микроорганизм колонизирует поверхность эпителиоцитов («ключевые» клетки), конкурируя за адгезию с Lactobacillus.
Роль представителей рода Gardnerella при БВ остается спорной, поскольку различные его штаммы присутствуют как в здоровой микробиоте влагалища, так и при БВ [47]. Прогресс молекулярно-биологических исследований расширил понимание о видовом разнообразии рода Gardnerella. Влагалище здоровых женщин может быть колонизировано разными видовыми вариантами гарднерелл, тогда как в развитии БВ участвуют вирулентные штаммы. К основным факторам вирулентности G. vaginalis относят цитотоксичность, способность продуцировать сиалидазу, адгезию к эпителиальным клеткам и способность образовывать бактериальные пленки. Видовые варианты обладают разным уровнем вирулентности; и, возможно, все работы, посвященные G. vaginalis, предшествующие исследованиям, представленным Vaneechoutte M. et al., не относятся конкретно к G. vaginalis, а скорее, к Gardnerella spp. [48].
Биопленки, образующиеся на вагинальном эпителии, играют решающую роль в патогенезе БВ. Вид G. vaginalis считается первичным колонизатором, который может создавать основу для прикрепления других микробов, ассоциированных с БВ, что способствует дальнейшему развитию полимикробных биопленок. Установлено, что некоторые из изучаемых образцов биопленок G. vaginalis имеют пониженную метаболическую активность и более низкий уровень фактора вирулентности (ваголизин), что важно для длительной персистенции. Биопленки G. vaginalis могут присутствовать в образцах фаллопиевых труб и эндометрии, что, видимо, указывает на то, что биопленки G. vaginalis перемещаются в верхние отделы репродуктивного тракта и могут быть причиной неблагоприятных исходов беременности.
Atopobium vaginae, являющийся строгим анаэробным микроорганизмом, часто выделяется при БВ и усиливает экспансию G. vaginalis слизистой влагалища. Также в состав бактериальной пленки при БВ часто входят анаэробные бактерии Prevotella, Mobiluncus, Sneathia, Leptotrichia, Propionibacterium, Veillonellae, Bacteroides. Но результаты исследований состава биопленок показывают, что при типичной клинической форме БВ основную долю составляют Gardnerella spp. [49].
L. iners способна к выживанию в щелочной среде, присущей БВ, и действительно часто выделяется дуэтом с G. vaginalis. Однако характер взаимодействия этих микроорганизмов еще предстоит изучить. Известно, что геном L. iners содержит гены, определяющие возможность реагировать на быстро изменяющиеся условия окружающей среды, включая систему CRISPR-CAS для защиты от фагов и опероны для расщепления гликогена, маннозы и мальтозы. В условиях БВ происходит активная экспрессия именно этих генов [50]. Этот вид лактобацилл обладает пониженной метаболической активностью, но самым быстрым адаптационным и восстановительным потенциалом.
Заключение
На сегодняшний день вид L. iners изучается только в крупных научных учреждениях. В рутинной практике, как правило, выделению данного вида не уделяется должного внимания. Оптимальным условием для постановки верного диагноза является интегральный подход к оценке микробиоты влагалища, сочетающий классические и инновационные методы исследования. Однако даже при наличии технической возможности пациенткам далеко не всегда назначаются классические культуральные и молекулярно-биологические методы исследования одновременно. Молекулярно-биологические методы исследования все еще остаются дорогими по стоимости и доступны не во всей стране. При использовании только классического культурального метода может быть выдано заключение об отсутствии лактобацилл и назначены пробиотические препараты, направленные на восполнение их дефицита, которого в действительности нет. Тем самым может нарушаться хрупкое равновесие компонентов микробиоты, необходимое именно в данном случае и именно этому пациенту. В этой связи, а также с целью избегания ошибочного диагноза БВ возникла потребность в разработке питательной среды, позволяющей выделять прихотливые виды лактобацилл в повседневной деятельности микробиологических лабораторий различного уровня.
С появлением новых методов исследования расширяется наше понимание о структуре микробиоты различных полостей. Но значение ее компонентов для разных людей не одинаково, и, безусловно, предстоит проделать долгий научно-практический путь от общего понимания до персонифицированного подхода.
