Роль Е-кадгерина в формировании задержки роста плода

Красный А.М., Хачатурян А.А., Кан Н.Е., Хачатрян З.В., Тютюнник В.Л., Волгина Н.Е., Ганичкина М.Б., Мантрова Д.А., Садекова А.А.

1 ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России; 2 ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия
Цель исследования. Изучить взаимосвязь уровней растворимой (80 kDa) и трансмембранной (120 kDa) форм Е-кадгерина в плаценте с задержкой роста плода. Материал и методы. Исследованы плаценты, 18 из которых получены от женщин с синдромом задержки роста плода (основная группа) и 20 – с физиологически протекающей беременностью (группа контроля). Методом вестерн-блоттинга был определен уровень растворимой и зрелой формы Е-кадгерина в плаценте. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени определен уровень экспрессии гена Е-кадгерина. Результаты. Уровень трансмембранной формы Е-кадгерина в группе с задержкой роста плода был снижен в 2,5 раза, а растворимой формы – в 4,8 раза (p<0,05). Соответственно их соотношение составило в группе с задержкой роста плода 1,6 (p<0,05), в контрольной группе – 0,8 (p<0,05). Уровень экспрессии гена Е-кадгерина CDH1 в плацентах группы с задержкой роста плода был снижен в 1,3 раза по сравнению с группой контроля (р>0,05). Заключение. Низкий уровень растворимой формы Е-кадгерина в плацентах приводит к снижению пролиферации и подвижности клеток трофобласта, что может быть причиной формирования плацентарной недостаточности и, как следствие, задержки роста плода.

Ключевые слова

задержка роста плода
растворимый Е-кадгерин
клеточная адгезия
плацента

Задержка роста плода (ЗРП) – актуальная проблема современного акушерства, занимающая одно из ведущих мест, наряду с инфекционными причинами и врожденными аномалиями развития плода, в структуре перинатальной заболеваемости и смертности, характеризующаяся неспособностью плода достичь своего генетически запрограммированного потенциала роста [1, 2]. Несмотря на развитие и внедрение в клиническую практику методов прогнозирования, профилактики, диагностики и лечения плацентарной недостаточности и ЗРП, частота данной патологии не имеет тенденции к снижению [3]. Согласно современным представлениям, ЗРП оказывает влияние не только на внутриутробное состояние плода, но и на последующее развитие ребенка и во многом определяет уровень его здоровья на протяжении последующей жизни [4].

На территории России в настоящее время данная патология встречается в 5–18% случаев [5]. В 75% случаев до рождения ЗРП остается не выявленной, а данный диагноз ставится ретроспективно у беременных с низким риском его развития. Следует подчеркнуть, что ЗРП любой этиологии всегда сопровождается теми или иными изменениями в плаценте и является несомненным свидетельством наличия плацентарной недостаточности; ЗРП может быть связана с плодовыми, плацентарными и материнскими факторами, однако, в 40% случаев этиология ЗРП неизвестна. По характеру изменений фетометрических параметров выделяют симметричную и асимметричную формы ЗРП, а по сроку формирования – раннюю (26 нед. – 33 нед. 6 дней беременности) и позднюю (34–40 нед.). Известно, что основными регуляторами передачи питательных веществ и кислорода плоду от матери в плаценте являются клетки трофобласта. Последние представляют собой непрерывный специализированный слой эпителиальных клеток, которые покрывают всю поверхность ворсин плаценты и находятся в непосредственном контакте с материнской кровью. Одним из основных белков, участвующих в поддержании эпителиальной клеточной адгезии является трансмембранный белок Е-кадгерин (Е-кад), имеющий молекулярный вес 120 kDa, обеспечивающий целостность эпителиального слоя. Противоположенную функцию выполняет растворимая форма Е-кадгерина (рЕ-кад) с молекулярным весом 80 kDa, образующуюся при деградации молекулы E-кадгерина 120 kДа в результате кальций-зависимого протеолитического процесса [6]. Показано, что в протеолизе E-кад участвуют матриксные металлопротеиназы, трипсин, калликреин 7 и плазмин [7]. Образующаяся усеченная форма Е-кадгерина может функционировать как псевдолиганд, блокирующий нормальное взаимодействие E-кадгеринов, что приводит к снижению межклеточной адгезии [8]. Исследования показывают, что наличие рЕ-кад необходимо для пролиферации эпителиальных клеток. При этом добавление антител против рЕ-кад к культуре клеток эпителия вызывает прекращение деления и запускает дифференцировку [9, 10]. Кроме того, рЕ-кад может взаимодействовать с рецепторами факторов роста, в частности с рецептором эпидермального фактора роста (HER), запуская пролиферативные сигнальные каскады.

Таким образом, интерес представляет изучение роли молекул клеточной адгезии, в частности различных форм Е-кадгерина в развитии синдрома ЗРП.

Цель исследования: изучить взаимосвязь уровней растворимой (80 kDa) и трансмембранной (120 kDa) форм Е-кадгерина в плаценте с ЗРП.

Материал и методы исследования

Исследованы плаценты, полученные от 18 женщин с ЗРП (основная группа), и плаценты от 20 пациенток с физиологически протекающей беременностью (группа контроля). Всеми пациентками было подписано информированное согласие на участие в данном исследовании, которое было одобрено локальным этическим комитетом. Критериями включения в обеих группах являлись: одноплодная беременность, родоразрешение на сроке гестации с 37 недель до 40 недель 6 дней, наличие ЗРП в основной группе. Критерии исключения – тяжелая экстрагенитальная патология, многоплодная беременность, пороки развития плода, генетические и острые инфекционные заболевания матери, преэклампсия.

Вестерн-блоттинг. Равное количество белка (50 мкг), который был экстрагирован из средней ворсинчатой части плацент, подвергали электрофорезу 12% разделяющем и 6% концентрирующем акриламидных гелях. Перенос белков производился на PVDF-мембрану. Мембрану блокировали и затем инкубировали в течение ночи при 4°С со следующими первичными антителами: Е-кадгерин («Santa Cruz», USA) и GAPDH («Thermo Scientific», USA). Далее мембрану инкубировали с вторичными антителами с пероксидазой хрена при комнатной температуре в течение 1 часа. Изображения были получены с использованием системы визуализации ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, USA). Относительный уровень белка был рассчитан с помощью программы ImageJ.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Общая РНК экстрагировалась из плацент набором RNeasy Micro Kit («Qiagen», Germany). Обратную транскрипцию полной РНК проводили с помощью набора M-MLV («Invitrogen», CA, USA). Уровень экспрессии гена E-кадгерина с использованием системы ПЦР реального времени CFX96 («Bio Rad», USA). В качестве референсного гена был использован ген рибосомального белка RPL19. Относительные значения экспрессии были рассчитаны с помощью программы REST 2009. Праймеры представлены в табл. 1. ПЦР проводили по следующей программе: 95°С -5 мин. 45 циклов: 95°С -10 сек, 60°С -20 сек.

Статистическая обработка данных была произведена с помощью программ AtteStat и OriginPro 8.1. Анализ на нормальность распределений значений был проведен с помощью критериев Шапиро–Вилка. Для нормального распределения значения представлены в виде среднего значения и ошибки среднего (М±SEM). Для ненормального – в виде медианы, нижней и верхней квартили. Для оценки статистических различий использовался критерий Стьюдента (параметрическая статистика) и критерий Манна–Уитни, (непараметрическая статистика). Для проверки статистической значимости различий категориальных переменных использовался точный критерий Фишера. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Основные характеристики акушерско-гинекологического анамнеза, состояния пациенток и их новорожденных представлены в табл. 2.

Как видно из представленных в табл. 2 данных, пациентки исследуемых групп были сопоставимы по возрасту и индексу массы тела. Анализ структуры экстрагенитальной патологии показал, что у пациенток с ЗРП в 2 раза чаще отмечалась миопия различной степени, составляя 44,4 и 20% (по группам соответственно). Кроме того, в основной группе в 1,5 раза чаще выявлялась эктопия шейки матки, составляя 55,5 и 30,0% (по группам соответственно).

Масса плацент в основной группе была достоверно ниже (р<0,05), в отличие от группы контроля, и составила 294,4±20,7 и 580,3±17,6 г (по группам соответственно). Аналогичная тенденция отмечалась при определении массы тела новорожденных – 2282,8±82,1 и 3343,7±90,1 г (р<0,05).

При сравнении уровня растворимой и нерастворимой форм Е-кадгерина в лизатах плацент группы с ЗРП и контрольной группы методом вестерн-блоттинг были обнаружены значительные различия. Уровень растворимой формы Е-кадгерина был статистически значимо снижен в 4,8 раза, а трансмембранной формы – в 2,5 раза в группе с ЗРП. Значения относительного уровня белков составили для контрольной группы: Е-кад – 2,7±0,5 отн. ед., рЕ-кад – 3,5±0,57 отн. ед.; для группы с ЗРП: Е-кад – 1,1±0,2 отн. ед., рЕ-кад – 0,7±0,2 отн. ед. Соотношение трансмембранной к растворимой форме Е-кадгерина в группе с ЗРП составило 1,6 в контрольной группе – 0,8 (рис. 1, 2). Проведенный ПЦР-анализ в режиме реального времени показал, что уровень экспрессии гена Е-кадгерина CDH1 в плацентах контрольной группы был выше в 1,3 раза по сравнению с группой с ЗРП, но не имел статистической значимости (р=0,08). Относительные значения соответственно составили 0,4 (0,2; 0,9) и 0,3 (0,1; 0,4). Данные представлены в виде медианы, нижней и верхней квартили.

Лизаты плацент получены от женщин с физиологически протекающей беременностью и с синдромом ЗРП.

В контрольной группе уровень растворимой и нерастворимой формы Е-кадгерина достоверно увеличен относительно группы ЗРП (p<0,001).

Соотношение зрелой формы к растворимой форме Е-кадгерина в группе с ЗРП составило 1,56 в контрольной группе – 0,81 (в обоих случаях p<0,05). Данные на рисунках представлены в виде средних значений ± ошибка среднего.

Основной причиной ЗРП является плацентарная недостаточность, обусловленная развитием синдрома системного воспалительного ответа в плаценте [11]. Кроме того, формирование плацентарной недостаточности может быть следствием нарушения молекулярных механизмов, регулирующих инвазию трофобласта и образование спиральных артерий. В связи с вышеизложенным интерес представляет изучение одного из ключевых регуляторов клеточной пролиферации и инвазии – Е-кадгерина. В последнее время к растворимой форме Е-кадгерина появилось повышенное внимание исследователей, изучающих опухолевые процессы, в связи с описанным эффектом остановки пролиферации раковых клеток, их дифференцировкой или апоптозом при связывании рЕ-кад антителами [9, 12]. Однако исследования данного белка связанные с беременностью, как правило, сводились к изучению концентрации в крови. Так, было установлено, что наибольший уровень рЕ-кад наблюдается в 10–14 недель беременности (в период плацентации), что подтверждает его роль в формировании плаценты [13].

Для рЕ-кад описано несколько функций, представленных на рис. 3. Одна из них – это связывание внеклеточного домена трансмембраной формы Е-кадгерина, в результате чего клетка теряет связь с окружающими ее клетками и приобретает подвижность. Кроме того рЕ-кад может выступать как лиганд для рецепторов различных факторов роста, регулирующих пролиферацию в клетке, а также вызывающих экспрессию факторов, разрушающих межклеточные связи и внеклеточный матрикс, например матриксные металлопротеиназы [14].

В данной работе мы впервые рассматриваем соотношение рЕ-кад и Е-кад в плаценте. По-видимому, меньшее количество растворимой, чем трансмембранной формы Е-кадгерина приводит к неполному блокированию межклеточных связей трансмембранной формы Е-кадгерина, что значительно снижает или делает невозможной способность клетки к подвижности и делению. Вследствие вышеуказанных процессов часть клеток в плаценте не имеющих достаточных связей с рЕ-кад будет дифференцироваться с исходом в ряде случаев в апоптоз. Мы обнаружили, что уровень Е-кадгерина, отвечающего за межклеточную адгезию, в контрольной группе был значительно выше, чем в группе с ЗРП. Однако уровень растворимой формы в контрольной группе превышал уровень трансмембранной формы Е-кадгерина. Отношение Е-кад/рЕ-кад составило 0,8. В плацентах группы с ЗРП наблюдалась противоположенная динамика – уровень рЕ-кад был ниже относительно уровня Е-кад. Соотношение Е-кад/рЕ-кад составило 1,6.

Полученные данные свидетельствуют, что недостаточное количество растворимой формы Е-кадгерина в плацентах при ЗРП указывает на низкую пролиферацию и возможный апоптоз клеток плаценты. Это предположение также косвенно подтверждается значительно сниженной массой плацент в данной группе.

Для уточнения причин изменений уровней различных форм растворимой формы Е-кадгерина, была исследована экспрессия гена Е-кадгерина CDH1. Отсутствие достоверных различий указывает на возможность посттрансляционных модификаций Е-кадгерина, которые могут играть ключевую роль в сниженном образовании растворимой его формы и, как следствие, развитии ЗРП. С другой стороны, есть исследования показывающие, что в плазме матери во время беременности присутствует значительный уровень рЕ-кад, который мог бы компенсировать недостаток его в плаценте. Однако в случае формирования ЗРП вышеуказанные механизмы не развиваются или ограничены, что делает актуальным дальнейшие исследования уровня растворимой формы Е-кадгерина в крови матери при данной патологии.

Заключение

Таким образом, вышеизложенные данные указывают на значимость определения растворимой (80 kDa) и трансмембранной (120 kDa) форм Е-кадгерина, на взаимосвязь их уровней в плаценте при формировании ЗРП, что способствует пониманию механизмов развития данной патологии и появлению новых возможностей ее диагностики.

Список литературы

1. Стрижаков А.Н., Игнатко И.В., Тимохина Е.В., Белоцерковцева Л.Д. Синдром задержки роста плода. Патогенез. Диагностика. Лечение. Акушерская тактика. ГЭОТАР-Медиа, 2012; 120.

2. Unterscheider J, Daly S, Geary MP, Kennelly MM, McAuliffe FM, O’Donoghue K, Hunter A, Morrison JJ, Burke G, Dicker P, Tully EC, Malone FD. Optimizing the definition of intrauterine growth restriction: the multicenter prospective PORTO Study. Am J Obstet Gynecol. 2013 Apr; 208(4): 290.e1-6. doi: 10.1016/j.ajog.2013.02.007.

3. Макаров И.О., Юдина Е.В., Боровкова Е.И. Задержка роста плода. Врачебная тактика. МЕДпресc-информ, 2016; 56.

4. Gardosi J, Madurasinghe V, Williams M, Malik A, Francis A. Maternal and fetal risk factors for stillbirth: population based study. BMJ. 2013 Jan 24; 346: f108. doi: 10.1136/bmj.f108.

5. Ажибеков С.А., Путилова Н.В., Третьякова Т.Б., Пестряева Л.А. Роль генетически детерминированных особенностей энергетического обмена в формировании плацентарной недостаточности с исходом в синдром задержки роста плода. Акушерство и гинекология. 2016; 11: 11-15.

6. Wheelock MJ, Buck CA, Bechtol KB, Damsky CH. Soluble 80-kd fragment of cell-CAM 120/80 disrupts cell-cell adhesion. J Cell Biochem. 1987 Jul; 34(3): 187-202.

7. Symowicz J, Adley BP, Gleason KJ, Johnson JJ, Ghosh S, Fishman DA, Hudson LG, Stack MS. Engagement of collagen binding integrins promotes matrix metalloproteinase-9-dependent E-cadherin ectodomain shedding in ovarian carcinoma cells. Cancer Res. 2007 Mar 1; 67(5): 2030-9.

8. Masterson J, O’Dea S. Posttranslational truncation of E-cadherin and significance for tumour progression. Cells Tissues Organs. 2007; 185(1-3):175-9.

9. Brouxhon SM, Kyrkanides S, Raja V, Silberfeld A, Teng X, Trochesset D, Cohen J, Ma L. Ectodomain-specific E-cadherin antibody suppresses skin SCC growth and reduces tumor grade: a multitargeted therapy modulating RTKs and the PTEN-p53-MDM2 axis. Mol Cancer Ther. 2014 Jul; 13(7): 1791-802. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-13-0971. Epub 2014 Apr 18.

10. Brouxhon SM, Kyrkanides S, Teng X, O’Banion MK, Clarke R, Byers S, Ma L. Soluble-E-cadherin activates HER and IAP family members in HER2+ and TNBC human breastcancers. Mol Carcinog. 2014 Nov; 53(11):893-906. doi: 10.1002/mc.22048. Epub 2013 Jun 18.

11. Сюндюкова Е.Г., Медведев Б.И., Сашенков С.Л., Зайнетдинова Л.Ф., Канайкина А.Ю. Гистоморфологические особенности плаценты при преэклампсии. Медицинский вестник Башкортостана. 2014; 5(9): 104-17.

12. David JM, Rajasekaran AK. Dishonorable discharge: the oncogenic roles of cleaved E-cadherin fragments. Cancer Res. 2012 Jun 15; 72(12): 2917-23. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-3498. Epub 2012 Jun 1.

13. Duzyj CM, Buhimschi IA, Motawea H, Laky CA, Cozzini G, Zhao G, Funai EF, Buhimschi CS. The invasive phenotype of placenta accrete extravillous trophoblasts associates with loss of E-cadherin. Placenta. 2015 Jun; 36(6): 645-51. doi: 10.1016/j.placenta.2015.04.001. Epub 2015 Apr 14.

14. Najy AJ, Day KC, Day ML. The ectodomain shedding of E-cadherin by ADAM15 supports ErbB receptor activation. J Biol Chem. 2008 Jun 27; 283(26): 18393-401. doi: 10.1074/jbc.M801329200. Epub 2008 Apr 22.

Поступила 01.12.2017

Принята в печать 23.12.2017

Об авторах / Для корреспонденции

Красный Алексей Михайлович, к.б.н., зав. лабораторией цитологии ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России; старший научный сотрудник лаборатории эволюционной биологии развития ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-72. E-mail: alexred@list.ru
Хачатурян Анюта Ашотовна, аспирант ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (926) 845-39-53. E-mail: x.anyt37@mail.ru
Кан Наталья Енкыновна, д.м.н., зав. акушерским отделением ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (926) 220-86-55. E-mail: kan-med@mail.ru. Researcher ID B-2370-2015.
ORCID ID 0000-0001-5087-5946
Хачатрян Зарине Варужановна, аспирант ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (909) 656-24-56. E-mail: z.v.khachatryan@gmail.com
Тютюнник Виктор Леонидович, д.м.н., зав. 1-м акушерским физиологическим отделением ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (903) 969-50-41.
E-mail: tioutiounnik@mail.ru. Researcher ID B-2364-2015. ORCID ID 0000-0002-5830-5099
Волгина Надежда Евгеньевна, научный сотрудник лаборатории цитологии ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-72. E-mail: n_volgina@oparina4.ru
Ганичкина Мария Борисовна, аспирант ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (915) 239-77-43. E-mail: mariaganichkina@yandex.ru
Мантрова Диана Алексеевна, аспирант ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (909) 636-72-59. E-mail: d-mantrova@yandex.ru
Садекова Алсу Амировна, научный сотрудник лаборатории цитологии ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-72. E-mail: a_sadekova@oparina4.ru

Для цитирования: Красный А.М., Хачатурян А.А., Кан Н.Е., Хачатрян З.В., Тютюнник В.Л., Волгина Н.Е., Ганичкина М.Б., Мантрова Д.А., Садекова А.А. Роль Е-кадгерина в формировании задержки роста плода. Акушерство и гинекология. 2018; 6: 38-43.
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2018.6.38-43

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.