Мужское бесплодие является многофакторным синдромом, охватывающим широкое разнообразие расстройств, причина которого в более чем половине случаев неизвестна. Бесплодие у мужчин может быть диагностировано путем анализа спермы. По результатам спермограммы определяется ряд функционально важных параметров, чьи нормы устанавливаются рекомендациями ВОЗ и с течением времени уточняются [1].
В ряде исследований было обнаружено значительное увеличение частоты эмбриональных хромосомных аномалий (полиплоидий, нулисомий, мозаичности и анеуплоидий по половым хромосомам) в парах, где партнер является носителем деструктивных изменений сперматозоидов, таких как повышенный уровень фрагментации ДНК ядра или изменения в морфологии сперматозоидов [2].
Зачастую эякулят содержит сперматозоиды с повреждениями ДНК в виде двойных или однонитевых разрывов, что особенно характерно для субфертильных мужчин [3]. Существует множество работ, посвященных влиянию фрагментации ДНК ядра сперматозоида на репродуктивную функцию. Многие исследователи сходятся во мнении, что присутствует связь между высоким уровнем повреждения ДНК сперматозоида и потерей беременности на раннем сроке. Так, мета-анализ, основанный на 16 когортных исследованиях (2969 пар), показал значительное увеличение частоты случаев раннего выкидыша у пациентов с высокой степенью повреждения ДНК мужских половых клеток. Причем наиболее значимые результаты продемонстрировал метод TUNEL, что свидетельствует о его высокой чувствительности [4]. Также обнаружено, что сперматозоиды с численными хромосомными аномалиями более подвержены фрагментации ДНК, однако причина подобной взаимосвязи остается неизвестной. Тот факт, что метод ИКСИ (от англ. ICSI — IntraCytoplasmic Sperm Injection, введение сперматозоида в цитоплазму, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) позволяет аномальным сперматозоидам достичь яйцеклетки, привел к опасениям, что у полученного таким образом эмбриона возрастет риск появления аномалий генетического материала. В одном из исследований была обнаружена корреляция между долей сперматозоидов с нарушениями кариотипа и уровнем фрагментации ДНК (Р<0,05), в связи с чем было сделано предположение, что в ходе сперматогенеза имеет место апоптоз (процесс, который, как известно, сопровождается активной деградацией ДНК), направленный на устранение генетически аномальных сперматозоидов. Этот важнейший вывод проливает свет на биологические механизмы уничтожения аномальных сперматозоидов [5].
Фрагментация ДНК сперматозоидов коррелирует со стандартными параметрами спермограммы. Обычно первым шагом в диагностической оценке мужского бесплодия выступает оценка функциональных параметров сперматозоидов. Однако в связи с тем, что повышенный уровень фрагментации ДНК сперматозоидов является потенциальной причиной репродуктивной дисфункции, его исследование было предложено в качестве важного параметра оценки мужского бесплодия, особенно перед применением вспомогательных репродуктивных технологий [6]. Мужчины с высоким уровнем фрагментации ДНК имеют значительно более низкие шансы на зачатие естественным путем или с помощью таких процедур, как внутриматочная инсеминация или ЭКО. Парам с данным нарушением может быть предложен метод лечения ИКСИ, поскольку его использование продемонстрировало хорошие результаты [7].
Несмотря на многочисленные исследования, вклад повышенного уровня фрагментации ДНК сперматозоидов в появление хромосомных аномалий у плода недостаточно изучен. В данной связи целью настоящей работы было изучить встречаемость анеуплоидий (моносомий, трисомий, дисомий, нулисомий), а также делеций и амплификаций ДНК у эмбрионов в парах с повышенным и нормальным уровнем фрагментации ДНК ядра сперматозоидов.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 170 пар. Каждая пара прошла полное обследование в соответствии с Приказом МЗ РФ № 107Н от 13/08-2012 «О применении вспомогательных репродуктивных технологий в терапии женского и мужского бесплодия». Средний возраст женщин составил 31,6±3,8 года, мужчин – 35,5±6,5 года. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Определение уровня фрагментации ДНК проводилось методом TUNEL, при этом подсчитывалась доля TUNEL-позитивных клеток в препарате. Согласно литературным данным, пациенты, у которых обнаруживают более 15% TUNEL-позитивных сперматозоидов, имеют сниженную результативность ЭКО, и уровень выше 15% признается патологичным [8].
Отобранные для исследования пары были разделены на две группы с учетом уровня фрагментации ядра сперматозоидов: I группа (n=112) – пары с нормальным уровнем фрагментации ядра сперматозоидов, средний возраст женщин составил 31,6±3,8 года, мужчин – 35,5±6,5 года; II группа (n=82) – пары с повышенным уровнем ядра сперматозоидов более 15%, средний возраст женщин составил 31,8±4,1 года, мужчин – 36,5±5,4 года.
Со 2-го дня менструального цикла и до дня введения триггера овуляции пациенткам вводили индивидуально подобранную дозу рекомбинантного ФСГ (пурегон/гонал) от 112,5 МЕ до 200 МЕ в сутки. В процессе стимуляции дозу корригировали в зависимости от ответа яичников. При достижении фолликулами диаметра 14 мм, для предотвращения преждевременного пика ЛГ пациенткам вводился антагонист гонадотропин рилизинг гормона (цетрореликс 0,25 мг). Триггер овуляции вводили при наличии в яичниках ≥3 фолликулов диаметром ≥17 мм. Трансвагинальная пункция яичников выполнялась через 35–36 часов после введения триггера овуляции.
Всем пациентам была проведена программа экстракорпорального оплодотворения методом ИКСИ с последующей биопсией эмбрионов.
Оценку зрелости ооцитов в циклах ИКСИ проводили во время проведения процедуры ИКСИ, в день трансвагинальной пункции. Зрелой (MII) яйцеклетка считается при наличии четко различимого полярного тельца. Контроль оплодотворения проводили через 16–18 часов. Наличие двух четко различимых пронуклеусов (2PN) свидетельствовало о нормально оплодотворившемся ооците. Оценку степени развития и морфологию эмбрионов осуществляли ежедневно. Оценка морфологии проводилась по бальной системе на 2-е сутки. Эмбрионы, не имеющие никаких морфологических аномалий, получали максимальную оценку в 3,5 балла. При наличии отклонений от нормальных параметров в морфологии оценка эмбриона снижалась на 0,5 балла. Оценка эмбрионов 5-х суток осуществляется согласно классификации Гарднера. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты, подвергались биопсии трофоэктодермы на 5-е сутки развития и криконсервировались по протоколу Kitazato методом витрификации. Культивирование эмбрионов осуществляли в средах ISM1 и BlastAssist, Origio (Дания).
Забранный биопсийный биоматериал был подвергнут преимплатационному генетическому скринингу методом сравнительной геномной гибридизации на чипах (aCGH) с использованием оборудования фирмы Agilent (США). Полногеномную амплификацию ДНК исследуемых клеток проводили с помощью набора PicoPlex SingleCell WGA Kit (Rubicon Genomics, США). Мечение ампликонов выполнялось с помощью набора SureTag DNA labeling Kit Agilent (США) согласно прилагаемой инструкции. Меченые ампликоны наносили на биочип Sure Print G3 8×60 aCGH Agilent (США), гибридизировали в течение 16 часов, после чего проводили отмывку и сканирование на сканере биологических чипов Sure ScanMicroarrayScanner. Интерпретацию полученных результатов проводили с помощью программного продукта Agilent CytoGenomics 2.5.8.1.
В рамках представленной работы определялась частота эмбрионов с численными и структурными аномалиями хромосом. Для сравнения средних в группах применяли модификацию t-теста Стьюдента для наблюдений с весами [9], реализованную в пакете R language [10]. В качестве весов использовали число биопсированных эмбрионов. Для подтверждения полученных результатов также применяли непараметрический критерий Манна–Уитни–Уилкоксона, рассчитанный с помощью программы Statistica 6.0 [11].
Результаты и обсуждение
Данные, полученные в ходе исследования, приведены в таблице.
Статистическая обработка результатов преимплатационного генетического скрининга эмбрионов выявила достоверное отличие группы с повышенным уровнем фрагментации ДНК ядра сперматозоидов (более 15%) от группы с нормальными значениями данного показателя. Была обнаружена корреляция между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов отца и кариотипом полученных эмбрионов. Установлено, что частота нормального кариотипа составляет 47,96% при повышенном уровне фрагментации ДНК против 66,17% при нормальном уровне фрагментации (p<0,02).
Некоторые авторы также связывают нарушения репродуктивной функции мужчин с фрагментацией ДНК. В многочисленных работах была показана корреляция отклонения параметров спермы от нормальных с высоким количеством хромосомных аномалий в сперматозоидах, включая анеуплоидии, полиплоидии и аберрации [12]. Более того, фрагментация ДНК и дисперсия хроматина были повышены у бесплодных мужчин, и в особенности, у пациентов с олигоастенотератоспермией [13]. Проведенный нами анализ частоты трисомий и моносомий как по аутосомам, так и по половым хромосомам, не выявил статистически значимых различий между группами с нормальным и повышенным уровнем фрагментации ДНК. Вместе с тем, в рамках данной работы было обнаружено существенное увеличение частоты делеций и амплификаций у эмбрионов в парах с повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов (35,89% против 5,39% при нормальном уровне фрагментации, p<0,001), что позволяет предполагать возможность передачи нарушений в структуре ДНК сперматозоидов в генетический материал эмбриона. Также немаловажен тот факт, что согласно ряду исследований, повреждение семенной ДНК оказывает отрицательное влияние на оплодотворение и частоту имплантации эмбрионов и играет сопричастную роль в наступлении спонтанных абортов в ситуациях естественного наступления беременности [14].
Заключение
Степень целостности семенной ДНК, таким образом, может стать существенным предиктором для случаев мужского бесплодия. Это особенно значимо в случаях множественных неудачных попыток вспомогательных репродуктивных технологий, либо когда речь идет о пациентах – мужчинах позднего репродуктивного возраста, так как у последних наблюдается значительно большее, в сравнении с нормой, количество дефектов генетического материала сперматозоидов и эпигенетических нарушений [15]. Это позволяет нам предполагать, что общепринятые методы анализа спермы, а именно – определение концентрации, подвижности сперматозоидов и морфологический анализ (все указанные показатели обладают высокой биологической вариабельностью) более не являются достаточными для определения того, в какой степени нарушения в генетическом материале определяют мужское бесплодие. Действительно, в случаях, когда один или большее количество вышеописанных стандартных параметров не соответствуют нормативным, Всемирная организация здравоохранения рекомендует оценку нуклеарной стабильности спермы посредством анализа фрагментации ДНК и дисперсии хроматина спермы [16]. Применение данного исследования позволит семейным парам избежать дорогостоящих процедур, повторяющихся неудач или потерь беременности. Следует также отметить, что одним из наиболее эффективных способов отбора эмбрионов, способных к имплантации и не несущих генетических аномалий, является метод полногеномного генетического скрининга. Результаты представленного исследования позволяют сделать вывод о значимости анализа фрагментации ДНК ядра сперматозоидов отца и последующего преимплатационного генетического скрининга эмбрионов для эффективной реализации программ вспомогательных репродуктивных технологий.
