Воспалительные заболевания шейки матки составляют 60–70% среди всех случаев инфекционно-воспалительных заболеваний женской репродуктивной системы [1]. Они снижают защитные свойства цервикального канала и могут способствовать развитию воспалительных заболеваний органов малого таза, невынашиванию беременности, повышению риска внутриутробного инфицирования плода, послеродовых и послеабортных гнойно-септических осложнений, риска развития неопластических процессов шейки матки. Результаты исследований показали, что воспалительный процесс в многослойном плоском и цилиндрическом эпителии шейки матки, обусловленный бактериальными и вирусными инфекциями, способствует развитию дисплазии и рака шейки матки.
Роль вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска в развитии дисплазии и рака шейки матки доказана [2, 3]. При этом цервициты, ассоциированные с бактериальной флорой, способствуют инфицированию ВПЧ.
Согласно статистике ВОЗ, ежегодно в России регистрируется 15 000 новых случаев рака шейки матки [4].
В 2015 году в Российской Федерации показатель заболеваемости раком шейки матки составил 15,2, смертности – 5,2. В структуре онкопатологии у женщин рак шейки матки продолжает занимать третье место [5]. Несмотря на существующий скрининг, в России за последние 10 лет среднегодовой прирост смертности от рака шейки матки составил 7,22% [5]. Поэтому актуально обоснование методов обследования, позволяющих расширить группу риска по развитию неопластических процессов шейки матки с целью их дальнейшего наблюдения.
Цель исследования: изучить особенности экспрессии иммуногистохимических маркеров р16 и Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом, ассоциированным с бактериально-вирусной инфекцией.
Материал и методы исследования
Отделяемое мочеполовых органов, биоптаты тканей шейки матки 73 женщин в возрасте от 22 до 48 лет с верифицированным диагнозом «хронический цервицит», у которых по данным микробиологического исследования цервиковагинального отделяемого была обнаружена бактериальная, вирусная, бактериально-вирусная инфекция.
Критериями включения в исследование являлись: возраст 22–48 лет; аномальная кольпоскопическая картина; установленный диагноз хронического цервицита на основании клинико-лабораторного исследования.
Критериями исключения были: возраст менее 18 и более 48 лет; острый воспалительный процесс в области половых органов; беременность; кровотечение неясной этиологии; онкологические заболевания; тяжелая соматическая патология; деструкция шейки матки в анамнезе.
Всем женщинам было проведено клинико-лабораторное обследование согласно приказу Минздравсоцразвития № 572н от 01.11.2012 г.: микроскопическое исследование мазков из уретры, влагалища и цервикального канала с окраской по Граму, исследование цервиковагинального отделяемого микробиологическим методом и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для проведения ПЦР в режиме реального времени (ПЦР–РТ) (с указанием числа копий) с целью идентификации ДНК Chlamidia trachomatis (Сhl. trachomatis), Mycoplasma genitalium (M. genitalium), Mycoplasma hominis (M. hominis), Ureaplasma urealyticum (U. urealyticum), Trichomonas vaginalis (T. Vaginalis), вируса простого герпеса (Herpes simplex (HSV)) I и II типа, Сytomegalovirus (CMV), Virus Epshtein-Barra, ВПЧ материал из цервикального канала получали зондом универсальным ЗГУ «ЦМ» (производитель ООО «ЦентрМед») и помещали в специальные стерильные пробирки с транспортной средой Эппендорф. Выявление возбудителей инфекций (за исключением ВПЧ) проводили методом ПЦР-РТ с использованием диагностической системы Cobas 4800 (производитель Roche Diagnostics Швейцария). Выявление и типирование ВПЧ высокого (HPV High) онкогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68-й типы) и низкого онкогенного риска (HPV Low – 6, 11-й типы) проводили методом ПЦР-РТ с гибридизационно-флуоресцентной детекцией и использованием диагностических систем «Ампли-Сенс ВПЧ ВКР генотип-FL» (производитель «ИнтерЛабСервис», Россия).
Для проведения культурального исследования забор материала из цервикального канала и влагалища осуществляли специальными микробиологическими тампонами – тупферами Transystem (производство Cоpanitalia, Италия). После этого тампон – тупфер помещали в одноименный контейнер для бактериологического исследования и отправляли в лабораторию, где проводился посев на питательные среды для получения изолированных колоний: Escherichia coli (E. coli), Enterococcus spp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Sreptococcus pyogenis (Str. pyogenis), Candida albicans (C. albicans) по стандартной методике.
Всем женщинам проводилось онкоцитологическое исследование эпителия шейки матки с заключением по системе Бетесда 2003 года и кольпоскопическое исследование, результаты которого протоколировались согласно действующей международной терминологии, принятой в Рио-де-Жанейро в 2011 году. Диагноз хронического цервицита устанавливался при обнаружении в отделяемом эндоцервикса более 10 полиморфноядерных лейкоцитов в поле зрения светового микроскопа при просмотре более чем пяти полей зрения при 1000-кратном увеличении и наличии слизисто-гнойных выделений из цервикального канала на протяжении более двух месяцев [6]. Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения шейки матки были верифицированы данными цитологического исследования эпителия шейки матки и гистологического исследования биопсии тканей шейки матки. Биопсия тканей шейки матки проводилась под контролем кольпоскопии по показаниям: аномальная кольпоскопическая картина и получение цитологических мазков типа HSIL (высокая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения), ASC-H (атипичные клетки плоского эпителия, не позволяющие исключить высокую степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения), ASC-US (атипичные клетки плоского эпителия неясного значения). В полученном при биопсии материале было определено распределение р16 и Ki67 в эпителии шейки матки по слоям: в базальном слое, в 1/3 эпителиального пласта и в 2/3 эпителиального пласта шейки матки. Показатель экспрессии Ki67 оценивался как отношение клеток эпителия шейки матки с прокрашенными ядрами к общему числу клеток с неокрашенными ядрами в одном поле зрения при 400-кратном увеличении, выраженное в % по следующим критериям: показатель Ki-67 5%, 10–15%, 15% и более.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью специализированного пакета по статистической обработке данных Statistica for Windows. Критерий χ2 применялся для таблицы сопряженности в случаях, когда ожидаемые значения были не менее 10. В остальных случаях применялся точный критерий Фишера. За критерий статистической достоверности получаемых выводов брали общепринятую в медицине величину р<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Из 73 обследованных женщин были выделены группы с различными вариантами сочетания вирусной и бактериальной флоры. Варианты сочетания микрофлоры представлены в табл. 1.
Сравнительная оценка экспрессии иммуногистохимических маркеров проводилась в тех группах женщин, инфицированных ВПЧ или HSV II, где одинаковое сочетание микроорганизмов встречалось не менее пяти раз. Таким образом, в исследование включили 41 женщину, а сравнение групп проводилось в следующих вариантах сочетания инфекций:
- HPV Low +M. hominis/U. urealyticum (n=13);
- HPV High + Chl. trachomatis (n=6);
- HPV High +M. genitalium (n=7);
- HPV High + M. hominis/U. urealyticum (n=5);
- HPV High + HPV Low (n=5);
- HSV II+ кишечная флора: E.coli, Enterococcus spp. (n=5).
Достоверные различия (р<0,05) в распределении р16 в слоях эпителия шейки матки были получены при сравнении следующих ассоциаций микроорганизов (табл. 2):
- HPV High + M.genitalium – HPV Low + M. hominis/U urealyticum (р=0,04).
В данном варианте сравнения экспрессия р16 достоверно чаще (р<0,05) определялась в 2/3 эпителиального слоя шейки матки у женщин, инфицированных ВПЧ высокого онкогенного риска, в сравнении с женщинами, инфицированными ВПЧ низкого онкогенного риска, что согласуется с данными литературы, указывающими на роль ВПЧ высокого онкогенного риска в развитии дисплазии и рака шейки матки [2]. В остальных вариантах сравнения достоверных различий в распределении р16 в слоях эпителия шейки матки получено не было (р>0,05).
При анализе показателя экспрессии Ki67 у женщин исследуемых групп (1–6) статистически достоверных различий получено не было. Во всех вариантах сравнения р>0,05.
Таким образом, женщины с хроническим цервицитом и ассоциацией ВПЧ высокого онкогенного риска с условно-патогенными микоплазмами, вирусом простого герпеса II типа с кишечной флорой (E. coli, Enterococcus spp.) и женщины с ассоциацией ВПЧ высокого онкогенного риска с облигатными возбудителями инфекции (Chl. trachomatis, M. genitalium) имеют сопоставимую частоту экспрессии р16 в слоях эпителия шейки матки и показатель экспрессии Ki67.
При анализе распределения Ki67 в слоях эпителия шейки матки достоверные различия (р<0,05) были получены в следующих вариантах сравнения:
- HPV High+Chl. trachomatis – HPV High + M. hominis/U. urealyticum;
- HPV High+M. genitalium – HPV High + M. hominis/U. urealyticum.
Результаты сравнения представлены на рисунке, из которого видно, что у женщин с хроническим цервицитом, ассоциированным с ВПЧ высокого онкогенного риска в сочетании с облигатными возбудителями инфекции (Chl. trachomatis, M. genitalium), достоверно чаще (р<0,05) экспрессия Ki67 определяется в 2/3 эпителиального пласта шейки матки (100%) в сравнении с женщинами, инфицированными условно-патогенными микоплазмами (25%), у которых экспрессия Ki67 чаще определяется в 1/3 эпителия шейки матки (p<0,05).
В других вариантах сравнения, в том числе при сравнении HPV High + Chl. trachomatis с HPV High + M. genitalium, достоверных различий в распределении Ki67 в эпителии шейки матки получено не было (р>0,05).
Некоторые авторы указывают на роль хламидийной инфекции как предрасполагающего фактора заражения ВПЧ [7, 8], способствующего развитию цервикальной неоплазии [3]. С данными литературы согласуются результаты проведенного исследования: у женщин с хроническим цервицитом, ассоциированным с ВПЧ высокого онкогенного риска в сочетании с Chl. trachomatis, достоверно чаще (р<0,05) экспрессия Ki67 определялась в 2/3 эпителиального пласта шейки матки в сравнении с женщинами, инфицированными условно-патогенными микоплазмами.
Согласно мнению других авторов, любой воспалительный процесс, вызванный инфекциями с половым путем передачи (Chl. trachomatis, M. genitalium, U. urealyticum, M. hominis), может быть предрасполагающим фактором для последующего заражения ВПЧ из-за схожих путей передачи инфекции [9, 10], и как следствие, для развития неоплазии шейки матки. Полученные нами результаты согласуются с данным мнением. При проведении сравнительного анализа экспрессии р16 и показателя Ki67 женщины с хроническим цервицитом, ассоциированным с ВПЧ высокого онкогенного риска, инфицированные облигатными возбудителями инфекции (Chl. trachomatis, M. genitalium), и женщины, инфицированные условно-патогенной флорой, имели сопоставимую частоту экспрессии р16 в слоях эпителия шейки матки и показатель экспрессии Ki67. Однако с данными литературы [9, 10] расходятся полученные в исследовании результаты распределения Ki67 в эпителии шейки матки. Так, у женщин, инфицированных Chl. trachomatis или M. Genitalium, достоверно чаще (р<0,05) экспрессия Ki67 определялась в 2/3 эпителия шейки матки в сравнении с женщинами, инфицированными U. Urealyticum, M. hominis. Это может указывать на роль Chl. trachomatis и M. genitalium как предрасполагающих факторов заражения ВПЧ.
Выводы
- У женщин с хроническим цервицитом, ассоциированным с ВПЧ высокого онкогенного риска, распределение Ki67 в 2/3 эпителиального пласта шейки матки встречается в четыре раза чаще при инфицировании облигатными возбудителями инфекции, такими как Chl. trachomatis и M. genitalium, в сравнении с женщинами с хроническим цервицитом, ассоциированным с ВПЧ высокого онкогенного риска и условно-патогенными микоплазмами (M. hominis/U. realyticum).
- Женщины с хроническим цервицитом, ассоциированным с ВПЧ высокого онкогенного риска в сочетании с Chl. trachomatis и/или M. Genitalium, должны быть отнесены в группу риска по развитию неопластических процессов шейки матки.
- При обнаружении ассоциаций ВПЧ и вируса простого герпеса II типа с бактериальной флорой у женщин с хроническим цервицитом необходимо рекомендовать проведение терапии, направленной на создание нормоциноза влагалища.
- При обнаружении аномальной кольпоскопической картины у женщин с хроническим цервицитом с целью дифференциальной диагностики степени тяжести неоплазии гистологическое исследование тканей шейки матки необходимо дополнять исследованием экспрессии Ki67. Полученные данные позволят составить индивидуальный план ведения женщин с неоплазией легкой степени на фоне хронического цервицита в зависимости от репродуктивных планов и помогут снизить количество необоснованных хирургических воздействий на шейку матки.
