Определение уровня митохондриальной ДНК в крови для прогнозирования осложнений беременности

Скрипниченко Ю.П., Баранов И.И., Высоких М.Ю.

1 ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва; 2 ГБУЗ ДЦ 5 ДЗМ, Москва, Россия; 3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва, Россия
Актуальность. Митохондриальные дисфункции различной природы приводят к неконтролируемому окислительному стрессу (ОС), повреждающему клетки и ткани, что рассматривается как один из ведущих факторов патогенеза таких осложнений беременности, как преждевременные роды (ПР), преэклампсия (ПЭ) и синдром задержки роста плода (СЗРП). Возникло предположение, что изменения количества копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в крови беременной женщины могут служить биологическим маркером степени индукции ОС и повышения риска возникновения того или иного осложнения гестации. Цель исследования. Определение уровня мтДНК в плазме крови женщин при физиологическом и осложненном течении беременности. Материал и методы. Проанализировано течение беременности и исход родов у 142 женщин, по результатам анализа всех обследованных пациенток разделили на 4 группы: 1-я – женщины с физиологическим течением беременности (ФБ); 2-я – с ПР; 3-я – c беременностью, осложненной ПЭ; 4-я – женщины с беременностью, осложненной СЗРП. Количество мтДНК определяли в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Количество ПЦР-продуктов в реакции оценивали по значению Ct, определяемому как n-й цикл реакции, при котором флюоресценция достигает установленного порогового значения. Количество ПЦР-продукта целевого гена (D-петля мтДНК) нормировали на количество ПЦР-продукта ядерного гена β2-микроглобулина. Копийность мтДНК выражали в условных единицах 2(-ΔС). Результаты исследования. При осложненном течении беременности выявлено повышение уровня мтДНК уже в I триместре. У беременных с диагностированным СЗРП мтДНК повышена на 49% (р<0,01), у женщин с ПР – на 48% (р<0,01), у беременных с развившейся ПЭ – на 25% (р<0,05) по сравнению с ФБ. Относительный уровень мтДНК в группе женщин с физиологическим течением беременности составил 153±32, при ПР – 292±69, ПЭ – 205±84, СЗРП – 299±101. По результатам ROC-анализа чувствительность и специфичность метода определения мтДНК в крови беременных в I триместре в диагностике ПР составила 100 и 91% соответственно, ПЭ – 71 и 64%, СЗРП – 83 и 90%. Были определены пороговые значения содержания мтДНК в крови пациенток, ассоциированные с повышением риска развития ПР 2(-ΔС)≥209, ПЭ – 2(-ΔС)≥158 и СЗРП – 2(-ΔС)≥221. Заключение. Определение уровня мтДНК в плазме крови в I триместре беременности позволяет выделить группу женщин с повышенным риском развития ПР, ПЭ и СЗРП.

Ключевые слова

физиологическая беременность
преждевременные роды
преэклампсия
синдром задержки роста плода
осложнения гестации
митохондрии
митохондриальная ДНК

Окислительный стресс (ОС) определяют как дисбаланс между продукцией активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) и их утилизацией системой антиоксидантной защиты. Основным источником продукции АФК и АФА в клетке являются митохондрии. Митохондрии играют важную роль в регуляции энергетического метаболизма клетки, поддержании внутриклеточного кальциевого гомеостаза, запуске процессов апоптоза, а также в продукции АФК и АФА, выполняющих сигнальную функцию [1]. Во время беременности функциональная активность митохондрий повышается, так как к функции обеспечения энергией организма матери, добавляется функция обеспечения трансплацентарного переноса от матери к развивающемуся плоду питательных веществ и продуктов метаболизма в обратную сторону. Одновременно с повышением продукции энергии митохондриями во время беременности, повышается продукция АФК и АФА митохондриями, что сопровождается компенсаторным повышением активности антиоксидантной защиты. Такое состояние сбалансированного изменения окислительно-восстановительного статуса организма характерно для физиологического течения беременности и необходимо для нормальной плацентации и дальнейшего формирования плода [2]. Однако митохонд­риальные дисфункции различной природы приводят к неконтролируемому ОС, повреждающему клетки и ткани, что рассматривается как один из ведущих факторов патогенеза таких осложнений беременности, как преждевременные роды (ПР), преэклампсия (ПЭ) и синдром задержки роста плода (СЗРП) [3–8].

Митохондрии содержат в своем составе несколько копий собственной митохондриальной ДНК (мтДНК). Хотя количество мтДНК положительно коррелирует с количеством и размером митохондрий, оно также может изменяться не только при смене энергетических потребностей клетки, но и при усилении ОС и под действием других патологических факторов [9, 10]. В отличие от ядерной ДНК – мтДНК более подвержена повреждениям, в том числе в результате повышенной продукции АФК, поскольку имеет кольцевую структуру, не содержит интроны и другие некодирующие последовательности (в ядерной ДНК около 90% последовательности не несет информацию) и не защищена гистонам; кроме того система репарации мтДНК значительно менее эффективна. Накапливающиеся нарушение в структуре мтДНК провоцирует первичную митохондриальную дисфункцию, приводящую к снижению уровня АТФ в клетке и еще большему увеличению продукции АФК и АФА, обуславливая, тем самым, нарушение работы целых тканей и органов [11–17]. В некоторых экспериментальных работах и клинических исследованиях было показано, что изменение содержания мтДНК в крови положительно коррелирует с таковым в других тканях и может в определенной степени отражать процессы, происходящие в других тканях организма [18]. На основании того, что беременность связана с возрастающим ОС даже в случае физиологического ее течения, возникло предположение, что изменение количества копий мтДНК в разных тканях и в крови беременной женщины в том числе может служить биологическим маркером степени индукции ОС и повышения риска возникновения того или иного осложнения гестации. Так, Qiu с соавт. (2012) в ретроспективном исследовании показали, что риск развития ПЭ положительно коррелирует с количеством копий мтДНК в крови матери [19].

Поскольку вопрос раннего прогнозирования и, как следствие, своевременной коррекции осложнений гестации по-прежнему является очень актуальным в повседневной акушерской практике, более подробное исследование изменений количества мтДНК в крови беременных женщин представляет несомненный интерес.

Целью исследования стало определение числа копий мтДНК в плазме крови женщин при физиологическом и осложненном течении беременности.

Материал и методы исследования

Проанализировано течение беременности и исходы родов у 142 женщин, наблюдавшихся в женской консультации и обследованных в I триместре. В зависимости от результатов анализа характера течения беременности и исхода родов сформировано 4 группы: 1-я – женщины с физиологическим течением беременности (ФБ; отсутствие осложнений беременности, родоразрешение в сроке от 37 до 40 недель гестации); 2-я – женщины с ПР (родоразрешение в сроке от 22 до 37 недель гестации); 3-я – женщины c беременностью, осложненной ПЭ (согласно критериям ВОЗ развитие ПЭ на сроке гестации >20 недель); 4-я – женщины с беременностью, осложненной СЗРП (отставание размеров плода от гестационного срока, масса плода при рождении ниже десятого процентиля для данного срока гестации).

Общие критерии включения в исследование: наблюдение и обследование в I триместре; одноплодная беременность, наступившая самопроизвольно без использования методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ); информированное согласие пациентки на вступление в исследование.

Критерии исключения из исследования: отказ пациентки от участия в исследовании или добровольное желание прекратить его; женщины, обратившиеся в женскую консультацию во II или III триместре и не обследованные в I триместре; многоплодная беременность; беременность, наступившая с использованием методов ВРТ; прерывание беременности в сроке до 22 недель или антенатальная гибель плода; тяжелая психосоматическая патология.

Содержание мтДНК измеряли в плазме крови. Общую ДНК, содержащуюся в образце крови, экстрагировали с использованием набора реактивов ПРОБА-НК (ДНК-технологии, Россия), согласно инструкции фирмы-производителя. Количество выделенной ДНК в каждой пробе измеряли на спектрофотометре DS-11 (Novex, США). Количество мтДНК определяли в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Количество ПЦР-продуктов целевого гена – участка D-петли мтДНК (mtDNA D-loop), нормировали на количество ПЦР-продукта ядерного гена – β2-микроглобулина. В реакцию брали 100 нг общей ДНК, каждую пробу анализировали в трех повторностях. Количество ПЦР-продуктов в реакции оценивали по значению Ct, определяемому как n-й цикл реакции, при котором флюоресценция достигает установленного порогового значения. Значения относительной экспрессии, отражающей копийность мтДНК, выражали в условных единицах 2(-ΔС) [12, 20–22].

Статистическая обработка данных выполнена с использованием пакета прикладных программ SPSS Statistics 22.0. При расчетах использовали Т-критерий для независимых выборок, однофакторный дисперсионный анализ, критерий U Манна–Уитни для независимых выборок. Связь между изучаемыми показателями оценивали по результатам корреляционного анализа с использованием вычисления коэффициента корреляции Пирсона. Для оценки чувствительности и специфичности проводили ROC-анализ. Статистически значимыми считались отличия при р<0,05.

Результаты и обсуждение

По результатам анализа характера течения беременности и ее исхода группу с ФБ составили 105 женщин, с ПР – 14 женщин, с ПЭ – 12 женщин, с СЗРП – 11 женщин.

Возраст беременных в группах варьировал от 17 до 43 лет (средний возраст – 28,4±5,0 года). Средний возраст женщин в группе с ФБ составил 28,6±5,2 года, в группе с ПР – 27,4±4,7 года, в группе с ПЭ – 28,5±5,2 года, в группе с СЗРП – 27,5±4,1 года. Средняя масса тела пациенток в группе с ФБ – 63,4±10,5 кг, в группе с ПР – 69,2±2,8 кг, в группе с ПЭ – 81,2±21,4 кг, в группе с СЗРП – 58,1±5,1 кг.

Результаты определения относительного числа копий мтДНК в крови пациенток в I триместре беременности представлены в таблице и на рис. 1.

При сравнении групп с ФБ и ПР отмечено значимое увеличение (на 48%) содержания мтДНК в группе с ПР (р<0,01). Результаты ROC-анализа свидетельствуют о том, что увеличение среднего показателя копийности мтДНК 2(-ΔС)≥209 в крови женщин в I триместре беременности свидетельствует о повышенном риске ПР (рис. 2А). Площадь под кривой (AUC) равна 0,961, чувствительность метода составляет 100%, специфичность – 91%.

При сравнении групп ПР и ПЭ также выявлено значимое повышение (на 30%) уровня мтДНК в группе с ПР (р<0,05, рис. 1). При сравнении групп ПР и СЗРП не выявлено статистически значимых различий между группами по количеству мтДНК (р>0,05, рис. 1).

При сравнении группы ПЭ с ФБ обнаружено значимое увеличение уровня мтДНК на 25% (р<0,05). По результатам ROC-анализа пороговым значением повышения риска развития ПЭ является мтДНК 2(-ΔС)≥158. Чувствительность метода – 71%, специфичность – 64%, площадь под кривой равна 0,702 (рис. 2Б). Полученные нами результаты согласуются с работой Qiu с соавт., где они показали, что у беременных женщин с ПЭ уровень мтДНК в цельной крови был выше (средний показатель копийности составил 271,5) по сравнению с группой контроля (средний показатель копийности – 239,3) [19].

Ту же направленность изменений, что и в группах ПР и ПЭ, наблюдали при сравнении групп СЗРП и ФБ – достоверное повышение (на 49%) количества мтДНК в крови в группе СЗРП (р<0,01). По результатам ROC-анализа пороговое значение количества мтДНК – 2(-ΔС)≥221, чувствительность метода – 83%, специфичность – 90%, AUC=0,832 (рис. 2В).

При сравнении групп СЗРП и ПЭ обнаружено, что при СЗРП количество мтДНК в крови было выше на 31% (р<0,05, рис. 1). Схожие данные, повышение мтДНК у беременных с СЗРП также получены в работах Colleoni с соавт. (2010) и Mandò с соавторами (2014) [20, 23]. Не выявлено статистически значимых различий между группами с ПР и СЗРП (р>0,05).

Заключение

Одновременно с повышением эффективности энергопродукции митохондриями, которое в норме происходит при беременности, повышается продукция свободных радикалов, в частности АФК и АФА. Избыточное образование свободных радикалов на фоне недостаточной работы антиоксидантных систем, наблюдаемое при патологическом течении беременности, оказывает повреждающее воздействие на клетки и ткани, в результате чего в кровь может попадать большее количество мтДНК. В нашей работе при сравнении группы с ФБ и групп с осложненной беременностью мы показали, что повышение уровня мтДНК в крови в I триместре положительно коррелирует с развитием осложнений гестации и позволяет выделить женщин с возможным риском развития ПР, ПЭ и СЗРП. Остается не выясненным вопрос, предшествует ли наблюдаемое повышение уровня мтДНК в крови развитию патологии, носит ли оно компенсаторный характер или является следствием протекающих патологических процессов. Однако такое изменение количества копий мтДНК доступно для определения и представляет интерес в качестве возможного маркера развития осложнений гестации, поскольку вопрос раннего выявления и своевременного проведения комплекса профилактических мероприятий остается актуальным в акушерской практике.

Список литературы

1. Palikaras K., Daskalaki I., Markaki M., Tavernarakis N. Mitophagy and age-related pathologies: Development of new therapeutics by targeting mitochondrial turnover. Pharmacol. Ther. 2017; 178: 157-74.

2. Wu F., Tian F.J., Lin Y. Oxidative stress in placenta: health and diseases. Biomed. Res. Int. 2015; 2015: 293271.

3. Мартусевич А.К., Карузин К.А. Окислительный стресс и его роль в формировании дизадаптации и патологии. Биорадикалы и антиоксиданты. 2015; 2(2): 5-14.

4. D’Souza V., Chavan-Gautam P., Joshi S. Counteracting oxidative stress in pregnancy through modulation of maternal micronutrients and omega-3 fatty acids Curr. Med. Chem. 2013; 20(37): 4777-83.

5. Duhig K., Chappell L.C., Shennan A.H. Oxidative stress in pregnancy and reproduction. Obstet. Med. 2016; 9(3): 113-6.

6. Genc H., Uzun H., Benian A., Simsek G., Gelisgen R., Madazli R., Güralp O. Evaluation of oxidative stress markers in first trimester for assessment of preeclampsia risk. Arch. Gynecol. Obstet. 2011; 284(6):1367-73.

7. Ghaebi M., Nouri M., Ghasemzadeh A., Farzadi L., Jadidi-Niaragh F., Ahmadi M., Yousefi M. Immune regulatory network in successful pregnancy and reproductive failures. Biomed. Pharmacother. 2017; 88: 61-73.

8. Janssen B.G., Gyselaers W., Byun H.M., Roels H.A., Cuypers A., Baccarelli A.A., Nawrot T.S. Placental mitochondrial DNA and CYP1A1 gene methylation as molecular signatures for tobacco smoke exposure in pregnant women and the relevance for birth weight. J. Transl. Med. 2017; 15(1): 5.

9. Clay Montier L.L., Deng J.J., Bai Y. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 2009; 36(3): 125-31.

10. Lee H.C., Wei Y.H. Mitochondrial role in life and death of the cell. J. Biomed. Sci. 2000; 7(1): 2-15.

11. Кулида Л.В., Майсина А.И., Перетятко Л.П. Роль митохондриальной дисфункции в развитии патологии плаценты. Мать и дитя в Кузбассе. 2014; 2: 28-31.

12. Burnham P., Kim M.S., Agbor-Enoh S., Luikart H., Valantine H.A., Khush K.K., De Vlaminck I. Single-stranded DNA library preparation uncovers the origin and diversity of ultrashort cell-free DNA in plasma. Sci. Rep. 2016; 6:е27859.

13. Holland O., Dekker Nitert M., Gallo L.A., Vejzovic M., Fisher J.J., Perkins A.V. Placental mitochondrial function and structure in gestational disorders. Placenta. 2017; 54: 2-9.

14. Rudov A., Balduini W., Carloni S., Perrone S., Buonocore G., Albertini M.C. Involvement of miRNAs in placental alterations mediated by oxidative stress. Oxid. Med. Cell. Longev. 2014; 2014: е103068.

15. Valero T. Mitochondrial biogenesis: pharmacological approaches. Curr. Pharm. Des. 2014; 20(35): 5507-9.

16. Vyssokikh M.Y., Antonenko Y.N., Lyamzaev K.G., Rokitskaya T.I., Skulachev V.P. Methodology for use of mitochondria-targeted cations in the field of oxidative stress-related research. Methods Mol. Biol. 2015; 1265: 149-59.

17. Wu Y.T., Wu S.B., Wei Y.H. Metabolic reprogramming of human cells in response to oxidative stress: implications in the pathophysiology and therapy of mitochondrial diseases. Curr. Pharm. Des. 2014; 20(35):5510-6.

18. Kuznetsova T., Knez J. Peripheral blood mitochondrial DNA and myocardial function. Adv. Exp. Med. Biol. 2017; 982:347-58.

19. Qiu C., Hevner K., Enquobahrie D.A., Williams M.A. A case-control study of maternal blood mitochondrial DNA copy number and preeclampsia risk. Int. J. Mol. Epidemiol. Genet. 2012; 3(3): 237-44.

20. Colleoni F., Lattuada D., Garretto A., Massari M., Mandò C., Somigliana E., Cetin I. Maternal blood mitochondrial DNA content during normal and intrauterine growth restricted (IUGR) pregnancy. Obstet. Gynecol. 2010; 203(4): 365. e1-6.

21. Hernandez S., Moren C., Catalán-García M., Lopez M., Guitart-Mampel M., Coll O. et al. Mitochondrial toxicity and caspase activation in HIV pregnant women. J. Cell. Mol. Med. 2017; 21(1): 26-34.

22. Williams M.A., Sanchez S.E., Ananth C.V., Hevner K., Qiu C., Enquobahrie D.A. Maternal blood mitochondrial DNA copy number and placental abruption risk: results from a preliminary study. Int. J. Mol. Epidemiol. Genet. 2013;4(2): 120-7.

23. Mandò C., De Palma C., Stampalija T., Anelli G.M., Figus M., Novielli C. et al. Placental mitochondrial content and function in intrauterine growth restriction and preeclampsia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2014;306(4): E404-13.

Поступила 09.06.2017

Принята в печать 23.06.2017

Об авторах / Для корреспонденции

Скрипниченко Юлия Петровна, аспирант ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России; врач акушер-гинеколог ГБУЗ ДЦ 5 ДЗМ.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-94-92. E-mail: wonder_julia@mail.ru
Баранов Игорь Иванович, д.м.н., профессор, зав. оргметодотделом ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-94-92. E-mail: i_baranov@oparina4.ru
Высоких Михаил Юрьевич, к.б.н., зав. лабораторией митохондриальной медицины ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-76-33, доб. 1472. E-mail: m_vysokikh@oparina4.ru

Для цитирования: Скрипниченко Ю.П., Баранов И.И., Высоких М.Ю. Определение уровня митохондриальной ДНК в крови для прогнозирования осложнений беременности. Акушерство и гинекология. 2018; 2: 44-9.
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2018.2.44-49

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.