Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг (НИПС) анеуплоидий плода по крови матери используется для определения риска наличия анеуплоидий с 2011 года. Широкомасштабные исследования показали высокую чувствительность и специфичность метода для определения частых анеуплоидий. Наиболее высокие показатели чувствительности и специфичности достигаются для трисомии по 21 хромосоме [1]. Однако диагностической точности теста достичь не удается из-за возможных ложноотрицательных и ложноположительных результатов [2]. Несоответствие результатов НИПС и кариотипа плода может возникать из-за целого набора биологических причин: плацентарного мозаицизма, вариаций числа копий фрагментов хромосом у матери, исчезающего близнеца, онкологических заболеваний матери и фетоплацентарного мозаицизма. Большая часть ложноотрицательных результатов, для которых проведено исследование причин, объясняется фетоплацентарным мозаицизмом [2].
Описаны 2 механизма, которые могут объяснять возникновение мозаицизма. Оба механизма включают нерасхождение хромосом в процессе митоза или мейоза. В первом случае нерасхождение происходит в процессе мейоза, чаще всего у матери, что приводит к образованию трисомной зиготы, после чего в процессе митотических делений в части клеток происходит потеря лишней хромосомы. В результате образуется 2 линии клеток с нормальным и трисомным кариотипом. В клетках с нормальным кариотипом возможна однородительская дисомия. Во втором случае зигота имеет нормальный кариотип, а нерасхождение происходит в одном из первых делений митоза, что приводит к образованию 3-х клеточных линий: нормальной, трисомной и моносомной. Принято считать, что в случае анеуплоидии по аутосомам, моносомная клеточная линия быстро элиминируется, и при цитогенетическом исследовании детектируются только нормальные и трисомные клоны клеток.
Важным параметром при проведении НИПС является доля плодовой ДНК [3]. При слишком низкой доле плодовой ДНК увеличение представленности трисомной хромосомы может не достигать статистической значимости. Большинство лабораторий, выполняющих НИПС в качестве контроля качества теста измеряют долю плодовой ДНК и приводят информацию о ней в лабораторном заключении. Мозаицизм в клетках плода и плаценты может приводить к уменьшению доли трисомной плодовой ДНК, в то время как доля плодовой ДНК в целом остается достаточной для проведения теста, что, в свою очередь, может привести к ложноотрицательному результату. Ложноотрицательные результаты приводят к более позднему установлению наличия анеуплоидии у плода или к рождению ребенка с анеуплоидией [4–6]. Недавний обзор причин несоответствия результатов НИПС и кариотипа плода показал, что большая часть ложноотрицательных результатов остается без объяснения причин [2].
Данное исследование описывает необычный случай ложноотрицательного результата НИПС по трисомии по 21 хромосоме, который объясняется наличием у плода 3-х различных клеточных линий.
Описание клинического наблюдения
Женщина 35 лет с высоким риском трисомии по 21 хромосоме по результатам комбинированного скрининга обратилась в НЦАГиП им. Кулакова для генетического консультирования. Пациентке было предложено проведение инвазивной диагностики и разъяснены ограничения НИПС. Несмотря на это, пациентка отказалась от инвазивной диагностики. Забор крови для НИПС был проведен на сроке 15 недель гестации. По данным НИПС у пациентки был низкий риск наличия трисомий по 13, 18 и 21 хромосомам. Доля плодовой ДНК составила 10%.
После рождения ребенка возникло подозрение на наличие у ребенка синдрома Дауна. Сразу после рождения был проведен забор крови в пробирку с ЭДТА. Молекулярное кариотипирование с использованием микрочипов CytoScan Optima Array (Affymetrix, Santa Clara, CA) подтвердило наличие трисомии по 21 хромосоме. Для анализа наличия мозаицизма был проведен FISH анализ 101 клетки периферической крови с использованием зондов AneuVision (Abbott Molecular) на 5 хромосом (13, 18, 21, X, Y). Для 21 хромосомы было обнаружено 77 (76%) ядер с 3 сигналами, 18 ядер (18%) с 2 сигналами и 6 (6%) ядер с 1 сигналом.
Повторный анализ оставшейся аликвоты образца плазмы подтвердил предыдущий результат НИПС. Был получен низкий риск анеуплоидии по всем хромосомам и доля плодовой ДНК 10%. Соответствие образцов было подтверждено с использованием полиморфных SNP маркеров.
Повторный забор крови был проведен в возрасте 2 месяцев в пробирки с гепарином для проведения стандартного кариотипирования, кроме того проведен повторный анализ методом FISH.
Стандартное кариотипирование 100 клеток выявило мозаичный кариотип mos 47,XY+21[94]/46,XY[6], моносомных клонов клеток не было обнаружено. Анализ методом FISH 300 клеток периферической крови подтвердил наличие 3-х клонов клеток с 3 сигналами для 21 хромосомы в 256 ядрах (85%), с 2 сигналами в 56 ядрах (13%) и с 1 сигналом в 5 ядрах (2%).
Обсуждение
Несмотря на то, что принято считать, что в случае нерасхождения аутосом в результате митотического деления моносомная линия клеток быстро элиминируется, мы продемонстрировали, что небольшое количество клеток может сохраняться до рождения ребенка. Ткань плаценты не была доступна для анализа, но можно предположить, что низкая доля трисомных клеток в плаценте не позволила детектировать трисомию по 21 хромосоме с использованием НИПС.
Данное исследование продемонстрировало, что выявление мозаицизма в значительной степени зависит от метода, который используется для диагностики. Исследование образца крови с использованием молекулярного кариотипирования не выявило никаких признаков мозаицизма у ребенка. FISH анализ того же образца крови показал наличие 3-х клонов клеток. Стандартное кариотипирование периферической крови, забранной в возрасте 2-х месяцев, не выявило моносомных клеток; кроме того, только 6% проанализированных клеток имели нормальный кариотип. Согласно рекомендациям Европейского общества цитогенетиков, при стандартном кариотипировании, если не предполагается мозаицизм, проводится исследование 10–20 клеток. При таком количестве исследованных клеток нормальные клоны могли быть пропущены. Отсутствие моносомных клонов клеток в результатах стандартного кариотипирования может объясняться ошибками, которые вносит процесс культивирования. Повторный анализ крови методом FISH показал изменение соотношения различных клонов клеток, которое может быть вызвано тем, что выживаемость моносомных клеток ниже.
Соотношение разных линий клеток может различаться в разных тканях и изменяться в процессе гестации. Элиминация моносомных клеток в процессе развития беременности и влияние метода подтверждения анеуплоидии на итоговый результат может объяснить ложноотрицательные результаты, причины которых не были установлены [2].
Заключение
Этот случай иллюстрирует, что отрицательный результат НИПС не позволяет полностью исключить наличие анеуплоидии, демонстрирует важность скрининга 1-го триместра и ограничения НИПС в случае беременностей с высоким риском по данным комбинированного скрининга.
