Преэклампсия (ПЭ) остается одной из основных причин материнской и неонатальной заболеваемости и смертности во всем мире, осложняя 2–8% всех беременностей [1]. Этиология возникновения данного состояния не выяснена. Известно, что ПЭ представляет собой многофакторное осложнение беременности, а ее начало и прогрессирование могут быть обусловлены генетическим фоном матери, иммунной дезадаптацией, аномальной инфильтрацией трофобласта в спиральные артерии матки, дисфункцией эндотелиальных клеток, а также некоторыми экстрагенитальными заболеваниями матери [2]. Несмотря на то что молекулярные механизмы, способствующие развитию ПЭ, не совсем понятны, считается, что плацента играет ключевую роль в развитии данного осложнения [3]. Многочисленные исследования показывают, что в плацентах женщин с ПЭ происходит изменение экспрессии различных генов [4, 5], которые входят в сигнальные пути, регулирующие инвазию трофобласта, ангиогенез, клеточную адгезию и выживание, систему ренин-ангиотензин-альдостерон, а также иммунный ответ [6–8]. Измененная экспрессия генов в плацентах женщин с ПЭ может указывать, что в ее развитии определенная роль принадлежит эпигенетическим модификациям, которые регулируют экспрессию генов без изменения основной последовательности ДНК. Метилирование ДНК является наиболее изученной эпигенетической модификацией, которая происходит в CpG-динуклеотидах и связана с транскрипционным молчанием. Было проведено несколько исследований, в которых изучалась роль эпигенетических модификаций, в частности метилирования ДНК в плацентах беременных, осложненных ПЭ. Эти исследования показали, что ряд областей генов гипер- и/или гипометилированы в плацентах при ПЭ по сравнению с контрольными образцами [9–11].
Целью исследования явилось изучение профиля метилирования генов в плаценте и в плазме крови при ПЭ.
Материалы и методы
Было изучено 52 образца плацент женщин после самопроизвольных и оперативных родов и 52 образца плазмы крови, полученных до родоразрешения вышеуказанных женщин. Все женщины, принимавшие участие в данном исследовании, наблюдались и были родоразрешены в ФБГУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Было сформировано 2 группы: основную группу составили 26 беременных с подтвержденным диагнозом ПЭ, из которых 12 – с умеренной (УПЭ) и 14 – с тяжелой формой преэклампсии (ТПЭ). Контрольную группу составили 26 пациенток с физиологическим течением беременности. Данное исследование было одобрено локальным этическим комитетом. Все женщины были ознакомлены с целью, задачами исследования и подписали информированное согласие на участие в нем. Критериями включения в исследование были: одноплодная беременность в сроке от 22 до 40 недель гестации, возраст беременных от 18 до 45 лет, отсутствие тяжелой экстрагенитальной патологии, наличие УПЭ или ТПЭ (для основной группы). Критериями исключения были: многоплодная беременность, острые инфекционные, аутоиммунные и онкологические заболевания, беременность, наступившая в результате вспомогательных репродуктивных технологий, тяжелая экстрагенитальная патология.
На первом этапе исследования были отобраны гены с потенциальной ролью в патогенезе преэклампсии – HLAG, GNA12, VEGF, TIMP2, MMP2, DAPK3, LEP, SOCS2, MEST, DKK3, TLR2, BMP6, RASSF1, CEBPA, CDO1, DFNA5, CTCF, PITX2, PTEN, SEPT9, CDH1, ICR (импринтинг контролирующей области) IGF2/H19. Во второй части работы был изучен уровень метилирования генов в плазме крови, имеющих аберрантное метилирование в плаценте женщин с ПЭ, для определения их потенциальной диагностической и прогностической значимости.
Забор плазмы периферической крови беременных женщин производился до начала родовой деятельности или оперативного вмешательства в количестве 5 мл в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА, которые были обработаны в течение 1 ч после забора. Плазма была выделена центрифугированием в два этапа при 4°С: первый – 10 мин, 200 g, второй – 10 мин, 4500 g. Образцы плазмы хранили при температуре –80°С. В исследовании были использованы ворсины хориона в месте прикрепления пуповины. Образцы тканей хранили при температуре –80°С. ДНК из ткани выделяли с использованием колонок «К-сорб» («Синтол», Россия) согласно протоколу изготовителя. Далее ДНК подвергалась бисульфитной конверсии с использованием набора Epijet (Thermo Scientific, США), в результате которой все неметилированные цитозины конвертировались в урацилы, а метилированные не изменялись. После этого проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с праймерами к фрагменту островка метилирования генов-кандидатов, в результате которого урацилы заменялись на тимины. Отбор праймеров производился по критерию отсутствия CpG-динуклеотидов. Уровень метилирования исследуемого фрагмента определяли с помощью анализа кривых плавления с высоким разрешением (methylation-specific high resolution melts, MS-HRM) с использованием программного обеспечения Precision Melt Analysis Software, версия 3 (BioRad, США). Для количественной оценки метилирования использовались относительные единицы интенсивности флуоресценции (RFU) при температуре максимального расхождения кривых согласно методике, описанной ранее А.М. Красным и соавт. [12]. ПЦР и анализ кривых плавления с высоким разрешением проводили с использованием амплификатора CFX-96 (BioRad, США).
Статистический анализ
Результаты представлены в виде медианы, верхней и нижней квартили Me (Q1;Q3). Статистическая значимость различий определялась с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Для сравнения трех независимых групп использовали ранговый анализ вариаций по Краскелу–Уоллису. Сравнение групп по качественным признакам проводилось с помощью точного критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. При сравнении 3 групп применялась поправка на множественные сравнения. Для статистической обработки результатов и построения графиков использовались программы Attestat (Россия), Statistica 10 и OriginPro 8.5 (USA).
Результаты
При анализе возраста беременных в группе с ТПЭ достоверно чаще встречались женщины более старшей возрастной группы (p=0,012) относительно группы сравнения. Сравнение УПЭ с физиологической беременностью, а также внутригрупповое сравнение УПЭ и ТПЭ не выявило статистически значимых различий. Анализ массо-ростовых показателей не выявил значимых различий. Однако средний вес пациенток был выше в группах с УПЭ и ТПЭ. В структуре соматической заболеваемости в группе с УПЭ достоверно чаще встречались женщины с наследственными тромбофилиями (p<0,001). При изучении гинекологической заболеваемости значимых различий выявлено не было. Срок родоразрешения беременных с УПЭ и ТПЭ был достоверно ниже по сравнению с контрольной группой (p<0,001), что обусловлено критериями включения в группы исследования.
Клиническая характеристика обследованных беременных представлена в таблице.
Изучение метилирования 22 генов в плаценте выявило статистически значимые различия только в гене TLR2 и импринтинг контролирующей области ICR IGF2/H19 (рис. 1). Ген TLR2 показал повышенный уровень метилирования только в группе ТПЭ (р=0,003). Импринтинг-контролирующая область ICR IGF2/H19 показала снижение метилирования как при УПЭ, так и при ТПЭ (p<0,001).
В плазме крови беременных, принимавших участие в исследовании, был изучен только уровень метилирования генов, имеющих аберрантное метилирование в плаценте, для определения их потенциальной диагностической и прогностической значимости – TLR2 и ICR IGF2/H19. Результаты представлены на рис. 2.
Ген TLR2 показал достоверные различия только в группе ТПЭ (р=0,023). Импринтинг-контролирующая область ICR IGF2/H19 имела статистически значимые различия как при УПЭ (p=0,043), так и при ТПЭ (p=0,038).
Обсуждение
Известно, что нарушение формирования и функционирования плаценты приводит к различным акушерским осложнениям [13, 14]. Развивающиеся патологические изменения характеризуются нарушением генной экспрессии, которые могут быть следствием аберрантного метилирования ДНК. В данном исследовании был изучен профиль метилирования генов в плаценте при ПЭ. Было обнаружено, что гены TLR2 и ICR IGF2/H19 имели статистически значимые отличия при ПЭ.
ICR IGF2/H19 регулирует экспрессию импринтированных генов IGF2 и H19. В ряде публикаций показано снижение метилирования ICR IGF2/H19 при задержке роста плода [15, 16]. Однако данные о снижении метилирования данной области при ПЭ отсутствуют. При этом показано, что при ПЭ в плаценте может наблюдаться потеря импринтинга с увеличением экспрессии гена H19 [17], что может быть связано с деметилированием ICR IGF2/H19. Известно, что мРНК H19 в клетках выполняет противовоспалительную и противоапоптотическую функцию [18]; это позволяет предположить, что снижение метилирования ICR IGF2/H19 происходит как ответная реакция на повышенную активность иммунной системы при ПЭ для адаптации клеток плаценты. Ранее нами было показано, что при ПЭ наблюдается повышенная активность иммунной системы, приводящая к апоптозу в плаценте и к увеличению содержания фетальной ДНК в крови матери [19–21].
При изучении гена TLR2 были получены результаты, указывающие на повышение метилирования гена TLR2 при ТПЭ, что может свидетельствовать о его более низкой экспрессии в плаценте. Известно, что TLR2 распознает различные бактериальные и вирусные патогены, являясь важным звеном иммунной защиты. Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что нарушение экспрессии данного гена может приводить к неправильному распознаванию инфекционных патогенов и увеличению их количества в плаценте при ТПЭ. Описанные изменения могут играть важную роль в реализации патологического иммунного и развитии синдрома системного воспалительного ответа, характерного для ТПЭ. Некоторые исследователи отмечают роль инфекционных факторов в патогенезе ПЭ. Так, F. Arechavaleta-Velasco et al. [22] показали, что ТПЭ ассоциирована с присутствием аденоассоциированного вируса 2 в плаценте. Также имеются данные о том, что наличие однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в гене TLR2 у женщин может быть связано с развитием ПЭ [23]. W. Wujcicka et al. [24] обнаружили взаимосвязи между наличием SNP в гене TLR2 и повышением вирусной нагрузки цитомегаловируса у плода и матери. Таким образом, роль гена TLR2 в патогенезе ПЭ может играть важное значение, однако полученные результаты требуют дальнейшего изучения.
Заключение
Таким образом, нами получены результаты, которые могут свидетельствовать о роли метилирования гена TLR2 и импринтинг-контролирующей области ICR IGF2/H19 в развитии ПЭ. Было выявлено, что уровень метилирования изученных генов в плазме крови отражает уровень метилирования в плаценте. Вышеизложенные данные могут быть использованы для разработки новых методов диагностики и оценки степени тяжести ПЭ.
