Темпы развития перинатальной медицины, особенно в течение последнего десятилетия, позволили обнаружить молекулярно-генетические механизмы развития таких распространенных осложнений беременности, как привычное невынашивание, преэклампсия, преждевременные роды, задержка внутриутробного развития плода [2, 4, 8]. Попытка исследователей найти предикторы этих осложнений привела к более детальному изучению фундаментальных процессов имплантации и плацентации, что позволило выявить особенности нарушений, возникающих еще на доклиническом этапе их развития [11, 21]. Патогенетическая общность этих состояний подтверждается развитием системных сосудистых нарушений в виде плацентарного оксидативного стресса, дисбаланса про- и антиангиогенных факторов, эндотелиальной дисфункции [18, 19]. Однако высокий удельный вес данной патологии в структуре перинатальной заболеваемости и смертности обусловливает актуальность дальнейшего углубленного изучения особенностей этиологии и патогенеза для обеспечения своевременного и успешного лечебного воздействия.
Привычное невынашивание беременности (ПНБ) включает как привычный выкидыш (три и более последовательные потери беременности), так и привычное нарушение имплантации (отсутствие беременности при переносе в матку эмбрионов хорошего качества). В настоящее время в 50% случаев привычных репродуктивных потерь этиология остается неизвестной [6, 12], и можно предположить, что с этим идиопатическим состоянием связано изменение состояния эндометрия при условии полноценного эмбриона. При анализе состава эндометриальных лимфоцитов в секреторную фазу менструального цикла у пациенток с привычным невынашиванием беременности не было выявлено
значимого различия в проценте NK-клеток по сравнению со здоровыми женщинами [21]. Однако при иммуногистохимическом исследовании эндометрия у пациенток с повторными выкидышами выявлено преобладание популяции Т-лимфоцитов с фенотипом CD16+CD56+[13, 16]. Эти клетки способствуют снижению сопротивления и усилению кровотока в маточных артериях, что приводит к преждевременной оксигенации хориона (оксидативный стресс) и как следствие – к прерыванию беременности. Повышение у этого контингента больных количества клеток с фенотипом CD16+, характеризующихся высокой цитолитической активностью, является одной из причин спонтанных репродуктивных потерь [1–5]. Изолированную повышенную концентрацию клеток CD56+ связывают с риском потерь кариотипически нормальной беременности. Кроме того, отмеченное уменьшение количества клеток CD16- у женщин с ранними репродуктивными потерями в анамнезе создает неблагоприятную среду для роста и развития эмбриона [13, 16]. Состояние эндометрия и его васкуляризация являются косвенным отражением функциональной активности маточных NK-клеток (u-NK-клеток), являющихся одним из основных продуцентов сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР).
Ранее считалось, что основными регуляторами изменений, происходящих в эндометрии в течение менструального цикла, являются гормоны, синтезируемые в яичниках. Циклические изменения в эндометрии, происходящие ежемесячно в организме женщины, подготавливают матку к предстоящей беременности. Кульминация событий, направленных на создание в эндометрии благоприятных условий для имплантации эмбриона, имеет место в середину секреторной фазы менструального цикла, в результате чего формируется так называемое «окно имплантации». Однако было установлено, что, несмотря на высокую чувствительность клеток маточного эпителия к эстрогенам in vivo, они практически полностью перестают реагировать на физиологические дозы эстрогенов in vitro. Это свидетельствует в пользу наличия в организме факторов роста, являющихся медиаторами как эстрогенов, так и прогестерона за счет ауто- и паракринного действия, способствующих регуляции процессов пролиферации и дифференцировки в эндометрии [8, 11]. Эндометрий под воздействием факторов роста трансформируется за счет не только изменения его структуры, но и особенностей
васкуляризации, что очень важно для полноценной инвазии трофобласта [13]. Значение СЭФР
в эндометрии установлено в исследованиях как на моделях животных [14], так и у человека [12].
СЭФР и мРНК СЭФР выявлены в биоптатах эндометрия человека во все фазы менструального цикла и обнаруживаются в клетках железистого эпителия и строме. Трехкратное увеличение СЭФР в секреторную фазу происходит главным образом за счет его продукции эпителиальными клетками эндометриальных желез. Показано, что СЭФР является одним из важнейших факторов, стимулирующих сосудистый рост в яичнике и обеспечивающих быстрый рост капиллярной сети в процессе созревания и селекции фолликулов, формирование и функционирование желтого тела [22].
Вместе с тем процессы ангиогенеза эндометрия в периоды секреторной фазы менструального цикла и ранней беременности у пациенток с ПНБ требуют уточнения. Особый интерес при этом представляет сочетание активации периферических NK-клеток с нарушением гемодинамики эндометрия в секреторную фазу менструального цикла в отсутствие других факторов риска невынашивания.
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилось исследование содержания СЭФР в сыворотке пациенток с ПНБ в анамнезе.
Материал и методы исследования
В исследование вошли 94 женщины репродуктивного возраста. Основную группу составили 62 пациентки с привычным невынашиванием беременности I триместра. Группу контроля составили 32 здоровые рожавшие женщины. Углубленное обследование этих женщин было дополнено специальными методами исследования. У всех пациенток проведено исследование уровня СЭФР в периферической крови, иммунного статуса и УЗИ с цветовым допплеровским картированием сосудов эндометрия на 22–24-й день цикла (или на 6-й день после овуляции). Информированное согласие на использование крови для проведения исследования получено у всех женщин.
Кровь для исследования брали в стандартных условиях из кубитальной вены. Образцы сыворотки хранили при -70 °С до момента исследования. Анализ СЭФР в сыворотке проводился с помощью иммуно-ферментного анализа с применением коммерческого набора ELISA (R&D Systems, США). Проведение реакции и расчет результатов осуществлены в стандартных условиях согласно рекомендациям производителя.
Результаты исследования представлены как среднее ± стандартная ошибка (M±SE). Достоверность
различий полученных результатов определялась использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Кроме того, для выявления существования прямой и обратной связи между признаками проводился ранговый корреляционный анализ Спирмена. Для автоматизации статистической обработки использован статистический пакет Statistica for Windows 6.0. Различия между группами считались достоверными при значениях p<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Результаты исследования исходного состояния эндометрия и гемодинамических показателей матки у женщин в середину секреторной фазы менструального цикла (предполагаемая имплантация) выявили секреторную трансформацию эндометрия у 27,4% женщин с ПНБ и у 85,7% здоровых женщин (p=0,008). Кроме того, у пациенток основной группы в фазу предполагаемой имплантации эндометрий был достоверно тоньше, чем в группе контроля (7,5 и 10,9 мм соответственно, p<0,0001). Сравнительный анализ гемодинамических показателей матки выявил статистически значимое их снижение у женщин с потерями беременности в анамнезе. Так, систоло-диастолическое соотношение в маточных артериях было почти в 2 раза выше, чем в группе контроля (p<0,0001), пульсовой индекс более чем в 1,5 раза выше, чем у здоровых женщин (p<0,0001). Как следствие затрудненного кровотока в маточных артериях кровоток в сосудах меньшего калибра (аркуатные, радиальные
и базальные артерии) не визуализировался, что в определенной степени обусловило и снижение толщины эндометрия с нарушением его функционального состояния в секреторную фазу менструального цикла. Кроме того, достоверные различия по сравнению со здоровыми женщинами касались лимфоцитов с фенотипом CD56+, CD56+16-, CD56+16+, ответственных за клеточно-опосредованные механизмы гибели эмбриона. У пациенток основной группы имел место достоверно низкий уровень СЭФР по сравнению с пациентками контрольной группы (41,20 и 193,05 соответственно, p<0,0001).
С целью повышения секреции СЭФР пациенткам с ПНБ в анамнезе была назначена подготовка к беременности с применением препаратов, косвенно влияющих на ангиогенез сосудов эндометрия. С учетом выраженных нарушений иммунного статуса после рандомизации 32 пациенткам (1-я подгруппа) был назначен метилпреднизолон с 1-го по 25-й день менструального цикла по 1 таблетке 2 раза в сут (8 мг/сут) и 30 женщинам (2-я подгруппа) – имунофан по 1,0 внутримышечно 1 раз в сут по схеме с 1-го по 25-й день цикла, курс – 10 инъекций. Кроме того, все пациентки получали препараты, направленные на улучшение кровотока в сосудах микроциркуляторного русла с 6-го по 20-й день цикла (дипиридамол по 0,25 мг 3 раза в сут) и прогестагены с 16-го по 25-й день цикла (утрожестан 100 мг 2 раза в сут). Ультразвуковое исследование с допплерометрией сосудов эндометрия, исследование показателей иммунного статуса и уровня ангиогенных факторов осуществлены на 22–24-й день цикла предполагаемого зачатия после 2-месячного курса предгестационной подготовки.
После проведенной терапии у всех женщин с ПНБ в анамнезе отмечена положительная динамика как в толщине эндометрия (10,06±0,50), так и в его структурном соответствии (92%). Однако применение метилпреднизолона привело к более выраженному положительному эффекту на гемодинамику матки по сравнению с терапией имунофаном, который заключается в увеличении частоты регистрации цветовых сигналов сосудов, визуализации базальных и спиральных артерий, уменьшении кривой спектра кровотока венозного типа в спиральных артериях. Кроме того, было выявлено, что терапия метилпреднизолоном в большей степени повлияла на уровень клеток с фенотипом CD56+, приведя его к нормативным значениям. У женщин 1-й подгруппы, принимавших метилпреднизолон, уровень СЭФР увеличился многократно и был достоверно выше, чем в группе контроля (400,40 и 193,05 соответственно, p=0,0001) (табл. 1). На фоне терапии имунофаном также произошло усиление секреции СЭФР, однако оно было сопоставимо с контрольной группой (161,8 и 193,05 соответственно, p=0,6).
Таблица 1. Динамика изменения маркеров ангиогенеза в зависимости от особенностей
предгестационной подготовки.
Таблица 2. Связь СЭФР с толщиной эндометрия и гемодинамикой матки.
При проведении рангового корреляционного анализа с подсчетом коэффициента Спирмена для установления связи уровня СЭФР со структурой эндометрия как до предгестационной подготовки, так и после выявлена значимая прямая связь между уровнем СЭФР и толщиной эндометрия. Так, чем выше сывороточный уровень СЭФР, тем больше была толщина эндометрия (p<0,001) и наоборот (табл. 2). Кроме того, наблюдалась значимая прямая связь между состоянием гемодинамики матки и толщиной эндометрия, а также между уровнем СЭФР и гемодинамическими нарушениями. Так, значения СЭФР
у женщин с ПНБ, получивших предгестационную подготовку, статистически значимо коррелировали с улучшением показателей кровотока матки (p=0,0006).
Как было указано выше, у всех пациенток с ПНБ в анамнезе имели место изменения иммунного статуса. Проведенный корреляционный анализ между уровнем СЭФР и количеством NK-клеток в периферической крови выявил достоверную обратную корреляционную связь (рис. 1, см. на вклейке).
Кроме того, исследование показало значимую обратную связь между уровнем NK-клеток, состоянием гемодинамики матки и толщиной эндометрия. Так, чем выше уровень этих клеток, тем хуже была гемодинамика матки и тоньше эндометрий (рис. 2, см на вклейке).
Множество исследований указывает на то, что для успешного течения беременности необходимо наличие полноценного эмбриона и рецептивного, насыщенного сосудами эндометрия в период «окна имплантации». Важнейшим условием формирования полноценного эндометрия является не только его морфологическая и сосудистая перестройка, а также насыщенность рецепторами, но и появление специфических клеток, способствующих в дальнейшем, при наступлении беременности, созданию иммунной толерантности в организме матери, адекватному неоангиогенезу и ремоделированию маточных артерий. Среди них – маточные естественные киллерные клетки (u-NK-клетки), которые представляют собой мигрирующую короткоживущую терминальную популяцию лейкоцитов децидуальной оболочки на ранних сроках беременности. u-NK-клетки имеют костномозговое происхождение и являются подвидом NK-клеток периферической крови, которые под влиянием стероидных гормонов (эстрогенов, прогестерона, прогестерон-индуцируемого блокирующего фактора) видоизменяются и превращаются в маточные, большая часть которых находится в децидуальной оболочке – основном месте инвазии трофобласта [9, 10, 13]. В небеременном эндометрии количество u-NK-клеток варьируется в зависимости от фазы менструального цикла – низкий уровень в фолликулярной фазе, возрастает после овуляции и достигает пика в конце лютеиновой фазы и в течение ранней беременности, если происходит имплантация [10]. Активность u-NK-клеток регулируется как аутокринными, так и паракринными механизмами [7]. Они синтезируют ряд цитокинов и факторов роста, способных непосредственно влиять на васкуляризацию децидуальной оболочки, секрецию гормонов, имплантацию. u-NK-клетки локализуются вблизи и/или структурно объединены внутри стенок эндометриальных сосудов, являются основным источником ангиогенных факторов, необходимых для неоангиогенеза плаценты при наступлении беременности
[20]. Кроме того, они способны синтезироватьиммуносупрессивные белки (например, гликоделин), играющие роль в регуляции иммунных процессов в системе мать-плацента-плод.
Изменения процессов ангиогенеза в процессе менструального цикла и как следствие – неадекватная васкуляризация желтого тела могут приводить к широкому спектру патологических состояний, диапазон клинических проявлений которых варьируется от недостаточности лютеиновой фазы до самопроизвольных выкидышей на ранних стадиях беременности [21].
В настоящем исследовании мы попыталисьнеинвазивно оценить функцию u-NK-клеток за счет определения уровня секреции СЭФР. Есть данные, свидетельствующие о низком содержании u-NK-клеток в секреторном эндометрии при высоких значениях периферических NK-клеток. Это может указывать на наличие нарушения ангиогенеза эндометрия. Тем не менее необходимость определения уровня периферических NK-клеток для диагностики состояния эндометрия у женщин с ПНБ в анамнезе остается дискутабельной [16].
Результаты нашего исследования показали наличие достоверно низкого уровня СЭФР в сочетании с высоким содержанием CD56+-клеток в периферической крови и нарушением структуры и гемодинамики эндометрия в секреторную фазу менструального цикла у женщин с ПНБ в анамнезе.
Была выявлена достоверная прямая корреляционная связь секреции СЭФР с толщиной эндометрия
и гемодинамикой матки, а также обратная связь с NK-клетками периферической крови. Наши результаты совпадают с данными других авторов, показывающими, что у женщин с потерями беременности имеет место высокая резистентность в маточных артериях [17]. Кроме того, фундаментальными исследованиями с использованием иммуногистохимии выявлена положительная
корреляционная связь u-NK-клеток с ангиогенезом эндометрия и снижением резистентности маточных сосудов [15]. Поскольку у наших пациенток с ПНБ в анамнезе имело место повышение NK-клеток периферической крови и нарушение гемодинамики матки, была назначена терапия, направленная на коррекцию выявленных нарушений. Назначение препаратов, снижающих количество CD56+-клеток, приводит к увеличению секреции СЭФР, нормализации структурности эндометрия и кровотока в базальных и спиральных артериях. Это создает благоприятные условия для имплантации бластоцисты. В этом отношении наиболее эффективным оказался метилпреднизолон, вызывающий выраженное снижение уровня CD56+-клеток за счет существования глюкокортикоидных рецепторов на поверхности NK-клеток и достоверно высокую по сравнению с группой контроля секрецию СЭФР.
Таким образом, результаты исследования показали, что в периоде предполагаемой имплантации у женщин с ПНБ в анамнезе отмечаются взаимосвязанные нарушения: активация CD56+-клеток в иммунном статусе, низкая секреция проангиогенного фактора СЭФР и нарушение гемодинамики матки, которые, вероятно, играют решающую роль в патогенезе ранних потерь беременности.
