Адекватное становление маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока является важнейшим фактором, обусловливающим физиологическое течение беременности и развитие плода. В период гестации до 6 нед беременности формируется первичная эмбриональная кровеносная система и плацентарное ложе с развитием ворсин, а также происходит интенсивная васкуляризация ворсинчатого дерева формирующейся плаценты. Период 6–8 нед беременности отмечен началом перехода к плацентарному кровообращению, а также наиболее выраженными процессами инвазии вневорсинчатого трофобласта в стенки спиральных артерий матери (так называемая первая волна инвазии трофобласта). Период 11—13 нед беременности считается пограничным, так как характеризуется завершением эмбриогенеза и началом плодного периода развития, процессами «затухания» первой волны инвазии трофобласта, дальнейшим приростом объема маточно-плацентарного кровотока [2, 4].
Основную роль в процессах образования сосудов играют ростовые факторы. Ключевыми регуляторами ангиогенеза являются члены семейства сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF). Децидуальные NK-клетки уже на ранних сроках беременности, на стадии, предшествующей инвазии клеток трофобласта в материнские артерии, продуцируют VEGF, фактор роста плаценты (PLGF), а также матриксные металлопротеиназы (MMP), в частности MMP-2 и MMP-9, которые специфически гидролизуют коллаген базальных мембран и тем самым способствуют инвазии клеток через базальные мембраны и стимулируют процессы ангиогенеза. Децидуальные NK-клетки являются основным источником MMP-2, а также TIMP-2, входящего в группу тканевых ингибиторов ММР (TIMP) [9, 10, 17].
Клетки трофобласта также продуцируют факторы, регулирующие процессы образования сосудов.
Так, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 и TIMP-3 продуцируются клетками вневорсинчатого трофобласта. Клетки ворсинчатого цитотрофобласта и инвазивного эндоваскулярного трофобласта продуцируют MMP-2, который, по данным некоторых авторов, считается ключевым регулятором инвазии клеток на ранних сроках (до 8 нед) беременности [5, 15].
С другой стороны, неотъемлемой частью нормального ангиогенеза является продукция антиангиогенных факторов. В результате молекулярного диалога, возникающего в процессе васкуляризации, продукция ингибиторов служит сдерживающим фактором для избыточной инвазии клеток трофобласта, а также препятствием для дальнейшего развития сосудистого русла и формирования васкуляризованных участков тканей, подвергшихся патологическим изменениям. Антиангиогенные факторы характеризуются высокой специфической экспрессией на эндотелии. К ним относятся VEGF-R1 (Flt-1), VEGF-R2 (Flk-1,KDR), VEGF-R3 (Flt-4). Растворимые формы этих рецепторов способны связывать ростовые факторы в циркуляции, замедляя или блокируя процессы ангиогенеза [19].
Поскольку растворимые факторы, участвующие в процессах образования сосудов, более доступны для исследования в материнской циркуляции, а изменение содержания их в крови матери также отражает изменение содержания этих факторов в циркуляции и тканях плода, то исследование данных факторов в материнской циркуляции имеет ключевое значение для осмысления и прогнозирования нарушения процессов морфогенеза сосудов.
Целью настоящего исследования явилось определение в сыворотке крови пациенток ангиогенных и антиангиогенных факторов как показателей, отражающих механизмы патологических реакций при ранних потерях беременности.
Материал и методы исследования
В проспективное исследование были включены 66 пациенток с беременностью ранних сроков. Контрольную группу составили 20 пациенток с физиологическим течением беременности. Все женщины этой группы имели одну или две беременности в анамнезе, завершившиеся родами
в срок, без особенностей течения гестационного периода.
В основную группу были включены 46 беременных женщин с невынашиванием в анамнезе и угрозой прерывания текущей беременности. Из них у 16 пациенток данная беременность завершилась рождением живого ребенка (основная подгруппа А), а у 30 пациенток имела место замершая беременность (основная подгруппа Б).
Критериями включения явились: две и более ранние потери беременности в анамнезе, отсутствие родов в данном браке, одноплодная беременность, наступившая в естественном цикле. Критериями исключения явились: эндометриоз, синдром поликистозных яичников, миома матки, экстрагенитальная патология (сахарный диабет, псориаз, системные и аутоиммунные заболевания, онкологические процессы), мутации генов фактора V (FV L) и фактора II свертывания крови (FII G20210A), а также случаи активации бактериально-вирусной инфекции.
По возрасту пациентки, включенные в группы исследования, были сопоставимы.
У пациенток основной и контрольной групп исследование ангиогенных факторов в образцах периферической крови осуществляли в сроки до 6 нед, 7–8 нед и 11–14 нед беременности. У пациенток основной подгруппы Б исследование проводили на момент постановки диагноза «замершая беременность» (на сроке до 6 нед были обследованы 8 пациенток, на сроке 7—8 нед – 14, на сроке 11—14 нед – 8 пациенток).
Забор периферической крови из локтевой вены для исследования ангиогенных факторов осуществляли не позднее 5 дней после ультразвуковой констатации остановки развития беременности и при условии интактного хориона (отсутствие ретроплацентарных и/или ретроамниотических гематом, кровянистых выделений из половых путей). Сыворотку до исследования хранили при температуре -80 °С.
Определение сывороточного содержания VEGF, VEGF-R1 (sFlt-1), VEGF-R2 (sKDR), MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, PLGF и эндоглина (sCD105) в сыворотке крови осуществляли с помощью иммуноферментного анализа с использованием стандартных тест-систем фирмы Bender MedSystems GmbH (Австрия) и R&D Systems (США). Измерение оптической плотности производили с помощью планшетного ридера BioTek (США) при длине волны 450 нм. Построение калибровочного графика и расчет концентраций VEGF, sFlt-1, sKDR, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, PLGF и эндоглина (sCD105) производили по уравнениям линейной регрессии в логарифмических координатах.
Статистическую обработку данных производили с использованием пакета статистического анализа для Microsoft Office Exсel 2007, пакета программ Statistica for Windows 7.0, Statsoft Inc. (США). Проверку нормальности распределения полученных параметров в группах проводили с помощью W-критерия Шапиро-Уилка. Достоверность различий средних значений измеренных показателей оценивали с помощью двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Результаты измерения концентраций растворимых форм про- и антиангиогенных факторов в сыворотке представлены в таблице. При анализе содержания комплекса растворимых факторов в сыворотке крови пациенток с физиологической беременностью обнаружено, что содержание VEGF имеет максимальные значения на сроке до 6 нед беременности, статистически значимо снижаясь более чем в 10 раз в последующих точках наблюдения. При этом в содержании VEGF на сроках 7—8 и 11—14 нед статистически значимых различий нет. Содержание PLGF на сроках до 6 нед и 7—8 нед имеет приблизительно одинаковое значение, повышаясь более чем в 2 раза к 11—14 нед, что согласуется с литературными данными [18]. Такая тенденция в изменении VEGF и PLGF в течение ранней беременности, вероятно, обеспечивает проангиогенное состояние, поскольку при снижении VEGF, PLGF способен синергично усиливать ангиогенез, вызванный действием VEGF. Концентрация растворимого эндоглина достоверно выше на сроке 7—8 нед по сравнению с содержанием на сроке до 6 нед с дальнейшей тенденцией к повышению к сроку 11—14 нед беременности.
Таблица. Содержание про- и антиангиогенных факторов сыворотке крови женщин в I триместре беременности.
Содержание sVEGF-R1 постепенно значимо повышается от значений в ранних сроках к максимуму на сроке 11—14 нед (р<0,05). Содержание sVEGF-R2 в контрольной группе имеет статистически значимую тенденцию к снижению на сроке 7—8 нед беременности с последующим возвращением к исходному уровню к 11—14 нед. Известно, что VEGF взаимодействует с рецепторами VEGF-R1 и VEGF-R2, тогда как рецептором для PLGF служит только VEGF-R1. При взаимодействии этих двух факторов с рецепторами наблюдается конкуренция за связь с VEGF-R1.
В условиях повышенной секреции VEGF и PLGF это приводит к истощению VEGF-R1 и преобладанию VEGF-R2 в циркуляции. Также предполагается, что PLGF способен замещать VEGF
в комплексе VEGF/VEGF-R1, активируя экспрессию VEGF-R2. По данным литературы, VEGF-R2 является центральным рецептором в ангиогенезе [17], несмотря на то что его аффинность к VEGF значительно ниже, чем у VEGF-R1 [14].
При беременности происходит интенсивная васкуляризация плаценты и органов развивающегося
плода [1]. Такую ситуацию можно охарактеризовать как «проангиогенное состояние». Однако количественно оценить его достаточно сложно, поскольку описанные модели взаимодействия ангиогенных факторов с рецепторами не дают ориентиров на количественное соотношение фактор/ингибитор, позволяющее делать вывод о проангиогенном состоянии, или, напротив, о заблокированном ангиогенезе [11, 16]. Поэтому тенденции, наблюдаемые при физиологической беременности, являются эталонными для проблемных случаев.
Содержание в крови ММР и их ингибиторов выглядит следующим образом: нет статистически значимых различий в концентрации ММР-2 и TIMP-2 на исследованных сроках беременности,
содержание их в крови незначительно варьируется. Достоверно значимое снижение концентрации ММР-9 и TIMP-1 обнаружено на сроке 7—8 нед при сравнении со сроком до 6 нед беременности. Постоянные концентрации в системе «протеазаантипротеаза» (MMP-2/TIMP-2) могут свидетельствовать о ремоделировании внеклеточного матрикса и морфогенезе сосудов, интенсивно происходящих в эти сроки: деградация интерстициальных коллагенов и коллагенов базальной мембраны, осуществляемая с участием этих факторов, носит стабильный характер.
Таким образом, тенденции, наблюдаемые при физиологической беременности на ранних сроках,
свидетельствуют о динамическом балансе растворимых факторов, обеспечивающем гомеостаз
в материнской циркуляции.
В крови пациенток основной подгруппы А с увеличением срока беременности возрастает содержание PLGF и sVEGF-R1. Наблюдаются статистически значимые различия их в содержании на разных сроках беременности. Концентрация эндоглина также возрастает (статистически значимо при сравнении значения на сроке до 6 нед со значением на сроке 11—14 нед). VEGF значимо снижается более чем в 30 раз от срока до 6 нед к 7—8 нед и далее остается практически на том же уровне к сроку 11—14 нед беременности. Отмечено статистически значимое снижение TIMP-1 на сроке до 6 нед к сроку 11—14 нед беременности и отсутствие статистически значимых различий в динамике ММР-2, ММР-9, TIMP-2 и sVEGF-R2.
Таким образом, для факторов VEGF, PLGF, эндоглин, MMP-2, TIMP-2 У беременных основной подгруппы А тенденции изменения содержания сывороточного уровня в точках исследования совпадают с наблюдаемыми при физиологической беременности, а для факторов sVEGF-R1, sVEGF-R2, MMP-9 и TIMP-1 – существенно отличаются от изменений в контрольной. Однако эти различия, по-видимому, не являются достаточными для возникновения драматических последствий для беременности. Вероятно, для благополучного исхода беременности необходима сбалансированная продукция VEGF и PLGF [12, 18], а также баланс между MMP-2 и TIMP-2, поскольку MMP-2 служит ключевым регулятором инвазии трофобласта [5, 15], особенно на ранних сроках беременности.
Проявление патологии у беременных на сроке до 6 нед (подгруппа Б) характеризуется статистически значимыми отличиями в содержании sVEGF-R1, PLGF, MMP-2, TIMP-1 и TIMP-2. Так,
в крови беременных с замершей беременностью содержание PLGF ниже, чем в контрольной группе, однако нет статистически значимых отличий от основной подгруппы А. Значение содержания фактора sVEGF-R1 в этой группе не отличается от содержания в контрольной. Однако сравнение с основной подгруппой А показывает, что при проблемной беременности, которая далее завершается рождением ребенка, содержание данного фактора выше, чем при замершей беременности. Эти результаты могут свидетельствовать о существовании тонких механизмов регуляции взаимоотношений в системе «лиганд-рецептор», где основное значение имеет не столько определенный уровень содержания молекулы вещества, сколько взаимовлияние факторов друг на друга.
На сроке беременности до 6 нед статистически значимые отличия выявлены для MMP-2, TIMP-1
и TIMP-2. Так, содержание MMP-2 в основной подгруппе А и в подгруппе Б значимо выше, чем
в контрольной группе, причем максимальное значение фактора наблюдается при замершей беременности. Содержание TIMP-1 и TIMP-2 в контрольной и основной подгруппе А различается
незначительно, в подгруппе Б содержание TIMP-1 статистически значимо ниже, а TIMP-2 значимо
выше на этом сроке беременности.
Таким образом, более явные различия, характерные для замершей беременности, выявляются
в группе факторов «протеаза-антипротеаза». Так, содержание факторов в системе MMP-2—TIMP-
2 до 6 нед является, вероятно, критическим для беременности, так как MMP-2 и TIMP-2 наиболее
значимы на ранних сроках гестации при инвазии клеток трофобласта в материнские ткани [5].
В этот временнóй отрезок наиболее важными являются процессы формирования плацентарного
ложа и васкуляризации ворсин [2, 4]. Известно, что эмбрионы, остановившиеся в своем развитии
на сроках 3—5 нед беременности, характеризуются наличием аваскулярных ворсин, значительной гидропической дистрофией стромы ворсин и отсутствием эмбриональных кровеносных сосудов
[3]. Дисбаланс ангиогенных факторов, воздействующих паракринно и аутокринно друг на друга и на
клетки, приводит к созданию микросреды, несовместимой с развитием беременности. Избыточная
протеазная активность при данной патологии может также отражать дегенеративные процессы, происходящие в матке до наступления аборта.
Патологические изменения, характерные для замершей беременности на сроке 7—8 нед, отражаются в статистически значимо повышенном содержании в крови VEGF-R1, VEGF-R2, и TIMP-2 по
сравнению с контрольной группой. Отмечается также достоверно сниженное содержание эндоглина при сравнении с основной подгруппой А.
Интервал 7–8 нед беременности отмечен первой волной инвазии клеток трофобласта в материнские артерии и началом маточно-плацентарного кровотока. Клетки вневорсинчатого трофобласта обладают инвазивным потенциалом и экспрессируют эндоглин, VEGF, PLGF и VEGF-R1 [20]. Фактор VEGF-R2 экспрессируется клетками фетоплацентарного комплекса [8, 20]. Необходимо отметить, что содержание VEGF-R1 в 5 раз и VEGF-R2 более чем в 2 раза отличается от контрольной группы. По литературным данным, растворимые формы VEGF-R1 и VEGF-R2 способны блокировать ангиогенез, негативно влиять на миграцию и пролиферацию эндотелиоцитов [14, 21, 22]. Однако сравнение с основной подгруппой А не имеет достоверно значимых отличий в рассматриваемый период беременности. Поэтому превышение уровня растворимых форм VEGF-R1 и VEGF-R2 в материнской циркуляции не является ведущей причиной данной патологии на этом сроке. Известно, что критической фазой и решающим условием дальнейшего развития плаценты и эмбриона является адекватный ангиогенез ворсинчатого дерева плаценты и ворсин хориона [4, 7]. Неадекватное начало гестационной перестройки маточных артерий, инициируемое в эти сроки, закладывает основы неблагополучия в системе мать-плацента-плод, которые развиваются в дальнейшем.
Ключевым процессом для беременности является инвазия цитотрофобласта в маточные артерии.
Параллельно происходит расширение просвета артериол под действием ММР. Избыток тканевых
ингибиторов на этапе 7–8 нед, вероятно, приводит к неполной инвазии трофобласта и недостаточному расширению просвета, что в условиях повышенной секреции VEGF-R1 и VEGF-R2 может привести к вазоспазму и повышению сосудистой проницаемости [6, 20], что негативно сказывается на развитии эмбриона.
Неразвивающаяся беременность, установленная на сроках 11—14 нед, характеризуется достоверным снижением содержания в крови sVEGF-R1, PLGF, MMP-2 и MMP-9 по сравнению с основной подгруппой А и с контрольной группой. Содержание TIMP-2 достоверно снижено по сравнению с основной подгруппой А, но по значениям близко к контрольной группе.
Конец I триместра беременности характеризуется началом плодного периода во внутриутробном развитии человека, затуханием первой волны инвазии трофобласта и подготовкой ко второй волне инвазии, которая осуществляется в 16—18 нед беременности. Обнаруженное нами в этом исследовании значимое снижение содержания в крови пациенток основной подгруппы Б растворимых форм VEGF-R1 и PLGF может свидетельствовать о вероятном влиянии этих факторов на патологический процесс, приводящий к потере беременности. Основным регуляторным фактором в I триместре физиологической беременности является PLGF [7, 18], выступающий как паракринный регулятор децидуального ангиогенеза и аутокринный регулятор функции клеток трофобласта [18]. Синергизм действия PLGF и VEGF на ангиогенез проявляется в морфогенезе более зрелой и стабильной сосудистой сети [18, 22]. Растворимая форма рецептора VEGF-R1 кроме ингибиторного эффекта на процесс ангиогенеза оказывает также и «поддерживающий» эффект, т.е. направленность эффекта зависит от уровня фактора в крови. В данной ситуации, по-видимому, уровни факторов sVEGFR1и PLGF являются недостаточными для адекватного ангиогенеза.
Эмбрионы, остановившиеся в своем развитии на сроках 7—11 нед, характеризуются значительной
выраженностью васкуляризации ворсин с преобладанием склеротических изменений в строме [2,
3].
Результаты, полученные в данном исследовании, могут свидетельствовать о возможном
использовании ММР и их ингибиторов, обнаруживаемых в материнской циркуляции, в качестве
молекул, сигнализирующих о проблемах беременности. Так, увеличение уровня MMP-2 на сроке до
6 нед беременности в основной подгруппе Б, вероятно, свидетельствует об интенсивных процессах
деградации внеклеточного матрикса, коллагена базальных мембран и деструктивных процессах,
происходящих в перицеллюлярном пространстве. Снижение протеазной активности, так же
как и снижение уровней содержания тканевых ингибиторов в крови пациенток группы сравнения на сроке 11—14 нед, может свидетельствовать об искажении процессов деградации и аутолиза для своевременного изгнания деградирующего эмбриона. Кроме этого значительно васкуляризованные эмбрионы, погибшие на сроках 7—11 нед беременности, вероятно, имеют другой механизм фатальных повреждений, связанный скорее с вторичными морфологическими нарушениями, обусловленными не влиянием факторов на ангиогенез, а формированием специфического микроокружения, приводящего к таким нарушениям. Таким образом, избыточная продукция протеаз, так же как и недостаток тканевых ингибиторов, вероятно, негативно влияет на развитие беременности. Это согласуется с данными о значительной экспрессии децидуальными NK-клетками тканевых ингибиторов TIMP-1, TIMP-2 и TIMP-3 при нормальной беременности, что является одним из механизмов, предотвращающих отторжение эмбриона [5].
Полученные результаты дают возможность предполагать различные иммунологические механизмы возникновения патологии беременности на ранних сроках. Ведущее значение при потерях
беременности на сроках до 6 нед и 7–8 нед имеют ММР и их тканевые ингибиторы. При потере беременности на сроке 11—14 нед обнаружены значимо сниженные уровни PLGF и sVEGF-R1, вероятно, недостаточные для адекватного ангиогенеза в эти сроки. Поскольку адекватный ангиогенез является детерминирующим фактором в развитии беременности, то выявление на ранних сроках критериев, сигнализирующих о неблагополучии в фетоплацентарной системе, будет также иметь диагностическую и прогностическую ценность.
