Одним из наиболее эффективных методов лечения бесплодия являются вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) [1]. Разработка новых модифицированных схем стимуляции и усовершенствование эмбриологического этапа позволили повысить результативность программ ВРТ; тем не менее, эффективность одной попытки не превышает 40%, а частота родов живым плодом составляет около 33,3% у пациенток до 37 лет [2]. Во многих исследованиях было показано, что для успешной имплантации необходим координированный «диалог» между рецептивным и восприимчивым эндометрием и качественным эмбрионом с максимальным имплантационным потенциалом. На сегодняшний день для оценки качества эмбриона и его имплантационной способности используются морфологические критерии, предложенные Gardner et al. [3], однако данный способ оценки остается субъективным, и не все эмбрионы «хорошего» или «отличного» морфологического качества успешно имплантируются [4]. Учитывая, что на сегодняшний день становится очевидным преимущество переноса одного эмбриона в полость матки, разработаны и предложены различные технологии, дополняющие выбор наиболее перспективного эмбриона [5]. Одной из широко применяемых методик, позволяющей оптимизировать селекцию эмбриона с высоким имплантационным потенциалом, является преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А) [6]. Тем не менее, несмотря на неоспоримые преимущества ПГТ-А в отношении повышения эффективности программ ВРТ, частота наступления беременности в циклах ВРТ при переносе эуплоидной бластоцисты составляет около 45–50% [7]. Кроме этого, наступление клинической беременности в цикле переноса эуплоидного эмбриона не гарантирует рождение здорового ребенка и не исключает наличие сбалансированных хромосомных аберраций и точечных мутаций, которые, в известной мере, влияют на развитие врожденных пороков развития.
Отсутствие имплантации эмбриона в программах ВРТ может быть связано не только с качественными характеристиками эмбриона, но и также с различными «материнскими» факторами [8].
Научные исследования последних лет сделали серьезный прорыв в изучении и понимании процессов раннего эмбриогенеза и имплантации эмбриона на молекулярном уровне, а также в поиске дополнительных способов оценки качества эмбриона и его имплантационного потенциала. Один из перспективных методов селекции эмбрионов заключается в определении копийности митохондриальной ДНК (мтДНК) в трофэктодерме (ТЭ) бластоцист при проведении ПГТ-А. Результаты нескольких работ показали, что эуплоидные эмбрионы с меньшим количеством копий мтДНК с большей вероятностью приведут к наступлению беременности [9, 10].
Основная функция митохондрий заключается в регуляции таких важных клеточных процессов как производство основного источника химической энергии аденозинтрифосфата (АТФ), регуляции процессов апоптоза, передачи сигналов кальция, управление активными формами кислорода, циклом образования пирувата и лимонной кислоты, синтезом гема и стероидов, а также передачей гормональных сигналов [11]. Митохондрии наследуются от матери [12], так как при оплодотворении митохондрии сперматозоидов разрушаются, и все митохондрии зиготы обеспечивает оплодотворенный ооцит. Отдельные органеллы могут содержать более одной копии митохондриального генома, а каждая клетка – множество митохондрий. Содержание мтДНК в различных клетках значительно варьирует: сперматозоиды содержат нескольких копий, а зрелые ооциты – около 100 000 митохондрий и от 50 000 до 550 000 копий мтДНК [13].
Учитывая, что биогенез митохондрий начинается во время имплантации эмбриона, а репликация мтДНК инициируется на стадии бластоцисты, достаточный уровень мтДНК в клетках кумулюса и в ооцитах как определяет повышенный потенциал женских половых клеток к оплодотворению, так и является одним из важных факторов, способствующих доимплантационному развитию эмбриона [14, 15]. Результаты нескольких исследований показали, что снижение содержания мтДНК в ооцитах связано с нарушением оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона [16]. Cecchino G. et al. и Hashimoto S. et al. показали, что во время начальных митотических делений содержание мтДНК остается стабильным, так как митохондрии и мтДНК ооцита равномерно распределяются по полученным бластомерам в зависимости от их объема [17, 18]. У эмбриона на стадии бластоцисты содержание мтДНК в клетках ТЭ постепенно снижается в связи с более крупным размером клеток и большим числом клеточных делений.
Две независимые группы авторов в 2015 г. впервые предложили использовать количественное определение мтДНК в качестве биомаркера качества и имплантационного потенциала эмбриона [9, 10]. Ученые показали, что эуплоидные бластоцисты, которые не привели к наступлению беременности в программе ВРТ, имели более высокое содержание мтДНК в клетках ТЭ по сравнению с эмбрионами, которые успешно имплантировались. В исследованиях было получено пороговое значение копий мтДНК, и эмбрионы, имеющие повышенный уровень мтДНК, не приводили к наступлению беременности, в отличие от эмбрионов с более низким содержанием мтДНК. После публикации результатов количественное определение мтДНК у эмбрионов привлекло пристальное внимание ученых и послужило началом дополнительных исследований, результаты которых подтвердили исходные данные [19–21]. Тем не менее другие авторы получили противоречивые результаты, ставящие под сомнение возможность применения мтДНК в качестве маркера качества и имплантационного потенциала эмбриона [22–26].
Учитывая неоднозначные данные предыдущих результатов, цель нашего исследования заключалась в изучении количественной оценки мтДНК в клетках ТЭ в качестве маркера имплантационного потенциала эмбриона и анализе исходов программ ВРТ при переносе одной эуплоидной бластоцисты после проведения ПГТ-А.
Материалы и методы
На базе отделения ВРТ в лечении бесплодия им проф. Б.В. Леонова ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России был выполнен ретроспективный анализ исходов программ ВРТ 187 супружеских пар. Было проанализировано 244 эуплоидных немозаичных бластоцисты, полученных в результате проведения программы ВРТ с ПГТ-А. Все пары подписали добровольное информированное согласие. Были проанализированы исходы 218 селективных переносов эмбриона в криопротоколе; из них 21 пациентке выполнено 2 криопротокола, 2 пациенткам – 3 криопротокола, 1 пациентке – 4 криопротокола и у 166 пациенток был проведен 1 криопротокол.
У всех пациентов начало овариальной стимуляции приходилось на 2–5-й день менструации по протоколу с использованием антагοнистов гонадοтропин-рилизинг гормοна и рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона или человеческого менопаузального гонадотропина. В качестве триггера финального созревания ооцитов использовался человеческий хорионический гонадотропин (ΧГЧ) в дозе 6000–10 000 ЕД внутримышечно по достижении диаметра фолликулов ≥17 мм. Через 36 ч после введения триггеρа производился забор ооцитов с помощью трансвагинальной пункции фοлликулов с последующей оценкой качества полученного материала. Сразу же после аспирации фолликулярной жидкости производили идентификацию ооцит-кумулюсных комплексов и оценку степени зрелости ооцитов под стереомикроскопом на нагретой поверхности стерильного ламинарного бокса. Оплодотворение ооцитов проводилось методом ИКСИ, после чего оплодотворенные клетки были перенесены в культуральную среду CSCM (Irvine Sc., США) с целью дальнейшего культивирования. Оценку наступления стадии двух пронуклеусов (формирования зиготы) проводили через 14–16 ч после оплодотворения. Все этапы культивирования выполняли в мультигазовых инкубаторах СООК (Ирландия) в каплях по 25 мкл под маслом (Irvine Sc., США). Среду CSCM (Irvine Sc., США) не меняли в течение 5 суток культивирования. На 5-е или 6-е сутки после оплодотворения была проведена процедура биопсии ТЭ с последующей криоконсервацией биопсированных эмбрионов. Полученные клетки ТЭ были перенесены в пробирки типа Эппендорф, содержащие лизирующий буфер, для проведения ПГТ-А с помощью методики высокопроизводительного секвенирования. Процедура ПГТ-А состояла из нескольких этапов: на первом этапе была проведена полногеномная амплификация и подготовка библиотеки для нанесения на чип. Для создания библиотеки к фрагментам ДНК присоединялись специальные молекулярные метки-баркоды, уникальные для каждого образца в постановке. Далее было выполнено ионное полупроводниковое секвенирование с последующим биоинформатическим анализом результатов и подготовкой заключения на основании полученных данных согласно стандартной методике ПГТ-А. Нормировка числа копий мтДНК осуществлялась на аутосомы согласно интерфейсу программного обеспечения производителя.
Через 1–2 менструальных цикла по результатам ПГТ-А производился перенос криоконсервированных/размороженных эуплоидных эмбрионов. Пациенткам назначалась циклическая гормональная терапия (с 4–5-го дня менструального цикла – эстрадиола валерат в дозе 6 мг/сут, с 15–16-го дня менструального цикла –микронизированный прогестерон 400–600 мг/сут вагинально) и осуществлялся ультразвуковой контроль динамики роста эндометрия на 9–10-й день менструального цикла и на 15–16-й день цикла для назначения гестагенов. Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся на 20–21-й день менструального цикла с помощью мягкого катетера Wallace (Германия) или Cook (Австралия). Предварительное размораживание эмбрионов и ведение посттрансферного периода осуществлялись согласно принятым в клинической практике протоколам.
В качестве основных клинических показателей исходов программ ВРТ оценивали частоту биохимической, внематочной и клинической беременности, выкидыша, имплантации, а также частоту живорождения. На 14-й день после переноса эмбриона пациентки сдавали кровь на содержание бета-субъединицы ХГЧ (β-ΧГЧ) для диагностики беременности. Положительный результат соответствовал уровню β-ХГЧ более 35 ΜЕ/л. При положительном результате β-ХГЧ для диагностики клинической внутриматочной беременности на 21-й день после переноса эмбриона выполняли трансвагинальное ультразвуковое исследование. Полученные результаты были представлены в виде модели, в которой частота выкидыша, внематочной беременности и клинической беременности были объединены в одну группу «положительный результат имплантации», а отсутствие наступления беременности при переносе эуплоидного эмбриона, а также биохимическая беременность соответствовали группе «отрицательный результат имплантации».
Статистический анализ
Анализ результатов проводился с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics версии 23.0 (США), а также с помощью таблиц Microsoft Excel. Для анализа количественных данных в группах определялся вид распределения данных (тест Колмогорова–Смирнова, графический анализ данных). Статистический анализ проводили с помощью теста Манна–Уитни при парном сравнении в случае, когда распределение не соответствовало закону нормального распределения. Для описания категориальных бинарных данных использовали абсолютные числа N и процентные доли от общего числа пациенток в группе P в формате N (P%). Непрерывные переменные были представлены в виде среднего и стандартного отклонения или в виде медианы (Ме) и межквартильных значений (Q1;Q3) на основе распределения выборки. Качество бластоцисты, тип анеуплоидии или условия культивирования соответствовали категориальным переменным. Оценка различий между днями проведения биопсии, полами эмбриона, исходами программ ВРТ (частотой имплантации и частой наступления клинической беременности) по уровню мтДНК была определена с помощью U-критерия Манна–Уитни из-за асимметричного распределения ответа. Для оценки корреляции между возрастом женщины и количеством мтДНК использовали корреляцию Пирсона. Зависимость степени экспансии бластоцисты (от 2 до 6) и количества копий мтДНК оценивали с помощью критерия Краскела–Уоллиса для нескольких независимых выборок. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05. Для более наглядного восприятия информации все значения мтДНК были умножены на 10,000.
Результаты
Количественная оценка мтДНК была выполнена на всех анализируемых 244 образцах. Распределение количества копий мтДНК в клетках ТЭ эуплоидных эмбрионов показало положительную асимметрию (1,508) и длительный эксцесс (3,568) (рис. 1). Согласно результату теста Колмогорова–Смирнова (р<0,001), распределение значений мтДНК значимо отличается от нормального. Медиана количества копий мтДНК и межквартильные интервалы составляли 15,40 (10,67;20,78), при этом стоит отметить большой разброс значений количества копий мтДНК: минимальное значение составило 2,06, максимальное – 60,70.
Количественная оценка мтДНК в зависимости от возраста матери
Материнский возраст выступал в качестве непрерывной переменной. Средний возраст женщин на момент трансвагинальной пункции составил 34,07 (4,08) года (диапазон: 26,0–43,0 года). Мы проанализировали корреляцию между количественным определением мтДНК и возрастом матери с помощью параметрической ранговой корреляции Пирсона. Количественный уровень мтДНК в общем количестве клеток ТЭ эуплоидных эмбрионов показал статистически незначимую и очень слабую корреляцию с возрастом матери (коэффициент корреляции Пирсона r=-0,098; p=0,102).
Количественная оценка мтДНК и эмбриональные факторы
В настоящем исследовании были проанализированы ряд эмбриологических факторов, которые потенциально могут повлиять на содержание мтДНК в клетках эмбриона. При оценке эмбриологических факторов была изучена связь между количеством мтДНК и днем проведения биопсии. В данном исследовании у 215 эмбрионов (88%) биопсию проводили на 5-й день (Д5) культивирования, 29 (12%) эмбрионам биопсию выполнили на 6-й день (Д6) после оплодотворения. При проведении статистической обработки данных было показано, что эмбрионы Д5 культивирования имели более высокое количество мтДНК по сравнению с эмбрионами Д6: 15,70 (11,10; 21,80) VS 11,50 (7,53; 16,55) соответственно, p=0,001 (критерий Манна–Уитни) (рис. 2).
Для ПГТ-А проводили биопсию бластоцист хорошего и отличного качества, определяемого с помощью оценки степени экспансии бластоцисты (2–6 баллов), качества внутриклеточной массы (ВКМ) (А или В) и клеток ТЭ (А или В). Была обнаружена статистически незначимая связь степени экспансии бластоцисты и количества копий мтДНК (р=0,178). Стоит отметить, что была отмечена взаимосвязь между степенью экспансии ранних бластоцист (1–2 балла) и повышенным количественным уровнем копий мтДНК, а бластоцист, у которых экспансия соответствовала 6 баллам – с пониженным содержанием мтДНК. Уровень значимости составил 0,041 при попарном сравнении двух групп, используя критерий Манна–Уитни. Однако при введении поправки Бонферрони различия между двумя группами не были статистически значимыми (рис. 3). При этом качество ВКМ бластоцисты не было связано с количеством копий мтДНК. Количество бластоцист с качеством ВКМ, соответствующей степени A, составляло 179 (73,4%), Ме 15,60 (10,60;22,10), степени B – 65 (26,6%), Ме 14,70 (10,55;19,35), р=0,253 (рис. 4). Сравнение количества копий мтДНК в клетках ТЭ показало, что бластоцисты с ТЭ, соответствующей категории отличного качества А (100 бластоцист, 41%), имели более высокие значения мтДНК (Ме 16,85 (12,12;22,25) по сравнению с эмбрионами, имеющие ТЭ хорошего качества В (144 бластоцист, 59%, Ме 14,50 (9,72;19,60), р=0,007). Значение корреляции по Спирмену между качеством клеток ТЭ и количеством копий мтДНК составило -0,174 с уровнем значимости р=0,006 (рис. 5).
В исследовании было также оценено влияние пола эмбриона на количество мтДНК. Статистически значимых различий в отношении пола эмбриона и уровня мтДНК обнаружено не было. В исследование было включено 110 эмбрионов ХY (45,1%) и 134 эмбриона ХХ (54,9%): Ме 15,55 (10,60; 20,43) против 15,30 (10,83, 21,23) соответственно, p=0,917 (рис. 6).
Оценка количественного уровня мтДНК в зависимости от исходов программы ВРТ
В данном исследовании средний возраст пациенток в группе с положительным результатом имплантации соответствовал 34,35 (4,31), а в группе с отрицательным результатом – 33,47 (3,91), р=0,144 (рис. 7). Группу с положительным результатом имплантации составили 102 пациентки (46,8%), из них у 1 женщины была диагностирована внематочная беременность, у 9 пациенток – выкидыш на 4–8-й неделе беременности, у 92 женщин – подтвержденная клиническая беременность. В группе с отрицательным результатом имплантации было 116 пациентов (53,2%), из них биохимическая беременность наступила у 5 женщин, отрицательный результат β-ХГЧ получен у 111 пациенток.
Значимой разницы в уровне мтДНК у пациенток в группе с положительным и отрицательным результатом имплантации получено не было: Ме 15,15 (10,60;20,63) против 14,47 (10,23;19,68) соответственно, p=0,56 (рис. 8). В обеих группах были зафиксированы выбросы, соответствующие высокому уровню мтДНК. Информация по исходам беременности и живорождению была собрана от 72 пациенток из 92 женщин с подтвержденной клинической беременностью.
На момент написания публикации у 16 женщин беременность развивается соответств