Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) – это хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся пролиферацией подобной эндометрию ткани вне полости матки. В связи с различными локализациями гетеротопий симптомы эндометриоза могут скрываться под маской других заболеваний, откладывая тем самым постановку диагноза и начало лечения. Согласно проекту клинических рекомендаций «Эндометриоз» (2024), в качестве гормономодулирующей терапии применяются пероральные прогестагены, левоноргестрел-выделяющая (52 мг) внутриматочная система, комбинированные оральные контрацептивы (КОК), агонисты гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), ингибиторы ароматазы [1]. В гайдлайне ESHRE «Эндометриоз» (2022) отмечена возможность применения антагонистов ГнРГ [2]. Агонисты и антагонисты ГнРГ, несмотря на свою эффективность в отношении болевого синдрома, имеют ограничения в применении в связи с выраженными побочными реакциями (приливы, потеря минеральной плотности костной ткани, сухость влагалища), поэтому рассматриваются как вторая линия терапии [2]. Также следует отметить, что накопленный опыт применения антагонистов ГнРГ является недостаточным [2, 3]. КОК, согласно рекомендациям ESHRE, могут снижать выраженность диспареунии, в особенности при применении в пролонгированном режиме [2]. Ингибиторы ароматазы в комбинации с прогестагенами, КОК или агонистами/антагонистами ГнРГ рекомендованы к использованию при рефрактерности к другому медикаментозному или хирургическому лечению [2, 4]. В связи с тем, что для эндометриоза характерно хроническое и рецидивирующее течение, назначаемая терапия должна быть долгосрочной. На сегодняшний день диеногест 2 мг является единственно разрешенным препаратом для длительного применения (до 7 лет). Однако у многих пациенток наблюдаются побочные реакции при его длительном применении, наиболее частыми из которых являются аномальные маточные кровотечения, межменструальные кровянистые выделения и головная боль [5]. Помимо развития нежелательных реакций, открытым остается вопрос подбора препарата пациенткам, имеющим противопоказания к гормональной терапии. Перспективными направлениями являются мелатонин, агонисты дофамина, ингибиторы окситоциновых рецепторов, метформин [4]. Необходимость противорецидивной терапии обуславливает сложности в выборе препарата на этапе планирования беременности, так как большинство из них обладают антигонадотропным действием. Дидрогестерон, как не блокирующий овуляцию прогестаген, может быть использован при планировании беременности. Он продемонстрировал свою высокую эффективность в терапии хронической тазовой боли [6]. Кроме того, в сравнении с агонистами ГнРГ дидрогестерон показал более высокую частоту наступления спонтанной беременности в течение первого года после окончания его применения у пациенток, перенесших лапароскопию [7].
Несмотря на наличие широкого спектра препаратов для гормономодулирующей терапии эндометриоза, предотвратить рецидивы достаточно часто не удается. По результатам исследования Lee N. et al. частота рецидивов эндометриоидных кист яичников на фоне гормональной терапии составила 8,3% среди пациенток 40–49 лет [8]. Систематический обзор 2020 г. показал, что на фоне применения КОК в циклическом режиме рецидивы случаются в 20–30% случаев, в то время как на фоне приема прогестагенов – до 9% [9]. Значимая актуальность данной проблемы направила вектор исследований на вещества растительного происхождения, а также витамины. Получены данные о высокой эффективности витамина D в терапии НГЭ [4, 10, 11], ресвератрола [12], кверцетина [13], N-ацетилцистеина [14], ретинола [15]. Другой перспективной молекулой для изучения является куркумин.
Куркумин – полифенол, получивший популярность в медицинских научных трудах благодаря широкому спектру своих фармакологических свойств. Впервые в 1815 г. Vogel H.A. и Peletier P.J. выделили его из корневища куркумы. Существует ряд работ, в которых доказана эффективность куркумина в терапии сердечно-сосудистых, неврологических и эндокринных заболеваний. Многочисленные исследования демонстрируют его противовоспалительные, антиоксидантные, антиангиогенные и антипролиферативные свойства. Так, в ряде экспериментов показана способность куркумина ингибировать активацию NF-κB-пути [16], который играет важную роль в развитии воспаления в клетках эндометриоидных гетеротопий. Xu Z. et al. продемонстрировали на модели ревматоидного артрита у мышей способность куркумина снижать экспрессию фактора некроза опухолей-α (ФНО-α), интерлейкина (ИЛ)-6 и ИЛ-17 [17]. Влияние куркумина на ангиогенез продемонстрировано на модели неоваскуляризации роговицы у крыс, где его использование привело к подавлению неоангиогенеза и снижению экспрессии васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) [18]. Высокий антиоксидантный потенциал, наряду с вышеупомянутым эффектом на ангиогенез, показан в работе Yao B. et al. на модели диабетической ретинопатии у крыс [19]. В данном исследовании терапия куркумином привела к значимому повышению антиоксидантной защиты за счет увеличения концентраций супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, а также к подавлению экспрессии VEGF. Использование куркумина на линии эндометриальных клеток козы нивелировало цитотоксический эффект частиц пластика [20]. Исследование влияния частиц пластика, в частности бисфенола AF, на линии эндометриальных клеток козы продемонстрировало активацию сигнального пути митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и усиление экспрессии ядерного фактора эритроидного происхождения-2 (Nrf2), в то время как терапия куркумином нивелировала описанный цитотоксический эффект, вызванный бисфенолом [20]. Помимо этого, в данном исследовании куркумин повысил антиоксидантную способность клеток за счет повышения концентрации СОД. Воздействие куркумина на процесс инвазии путем снижения экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММП)-2, -3 и -9 доказано в ряде работ [21, 22]. Влияние куркумина на определенные патологические процессы, установленное в экспериментах in vivo, отражено в таблице. Учитывая действие полифенола на основные патогенетические звенья, лежащие в основе развития эндометриоза, перспективным является изучение потенциала препарата в терапии данного заболевания. Более того, куркумин доказал свою эффективность в лечении нарушений углеводного и липидного обмена [23], которые также характерны для пациенток с эндометриозом.
Однако терапевтические эффекты куркумина имеют ограничение из-за его низкой биодоступности. В связи с этим были разработаны специальные липосомы и наночастицы, способные преодолеть крайне низкую растворимость молекулы [31, 32]. В проведенном нами экспериментальном исследовании куркумин использовался в мицеллярной высокорастворимой форме Novasol производителя Solgar. Данная формула позволяет преобразовать плохо растворимый в воде порошок куркумы в амфифильную мицеллу, благодаря чему биодоступность в 185 раз выше по сравнению с обычными препаратами на основе куркумы [33].
Цель исследования: оценить эффективность применения высокорастворимого мицеллярного куркумина в терапии хирургически-индуцированного эндометриоза у крыс линии Wistar.
Материалы и методы
В нашем исследовании эксперимент проведен на 17 самках крыс линии Wistar. Вес крыс в среднем составил 200±50 г. Лабораторные животные были закуплены в биопитомнике ООО «СМК СТЕЗАР» и содержались в виварии ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» в регламентированных условиях на протяжении всего эксперимента: свободный доступ к воде и еде, стандартный рацион питания, автоматическое переключение освещения в режиме день/ночь. В течение 2 недель перед началом эксперимента животные пребывали на карантине, после чего была произведена маркировка всех самок. В экспериментальной работе с животными обращались гуманно в соответствии с Хельсинкской декларацией [34].
Создание экспериментальной модели проходило в 3 этапа [35].
Перед вступлением в эксперимент в течение 7 дней у всех крыс производился забор влагалищных мазков для оценки фазы цикла. Для микроскопической оценки мазки окрашивались метиленовым синим.
Первый этап – создание хирургически-индуцированного эндометриоза у крыс. Оперативное вмешательство проводилось в фазу эструса в специальной операционной в асептических условиях. Для анестезии был использован золазепам с тилетамином в дозе 30 мг/кг.
Этапы операции. Крысы фиксировались на спине. После обработки операционного поля была проведена срединная лапаротомия (разрез 2 см). Далее были выделены правый рог матки и правый яичник. Перед иссечением маточный рог был перевязан на 3 мм выше места бифуркации, также была перевязана брыжейка яичника. После перевязки брыжейки яичника слева также была произведена овариоэктомия (в качестве шовного материала для перевязки использовался викрил 4.0). Выделенный маточный рог помещали в теплый изотонический раствор натрия хлорида, после чего, сделав продольный разрез, из него формировали имплантаты размером 3×3 мм. Полученные имплантаты также помещались в теплый изотонический раствор натрия хлорида. Для создания модели индуцированного эндометриоза производилась их фиксация на париетальную брюшину передней брюшной стенки справа и слева в месте бифуркации сосудов, таким образом, чтобы эндометрий прилегал к сосудам, а миометрий оказался со стороны брюшной полости. После фиксации имплантатов были выполнены гемостаз и ревизия брюшной полости. Операционная рана ушивалась послойно, шовный материал – викрил 3,0. Для проведения гистологической оценки фрагмент маточного рога фиксировался в растворе формалина 10%. В течение 5 дней для профилактики инфекционных осложнений проводилась антибиотикотерапия цефтриаксоном в дозе 50 мг/кг внутримышечно, а также противовоспалительная терапия кетопрофеном 2% в дозе 50 мг/кг. Для создания сопоставимого эстрогенного фона и отсутствия различий фаз менструального цикла всем крысам была произведена двусторонняя овариэктомия, после чего дважды в неделю вводился масляный раствор эстрадиола внутримышечно с момента операции и до конца исследования.
Второй этап – диагностическая лапароскопия для оценки результатов по созданию модели. Диагностическая лапароскопия была выполнена через 14 дней после первой операции. Операция проводилась в таких же асептических условиях, с использованием той же анестезии.
Этапы операции. Для проведения лапароскопии были использованы видеосистема для эндоскопии TELEPACK X; эндоскопическая видеокамера Telecam; жесткая оптика со стеклянными линзами, HOPKINS II, переднебокового видения, 30°, диаметр 2,7 мм, длина троакаров 18 см, размер 3,9 мм (Karl Storz, Германия). Животные фиксировались на спине. После обработки операционного поля скальпелем выполнялся разрез кожи в области пупка размером 2 мм. После этого иглой Вереша был выполнен прокол, и с помощью инсуффлятора создавался пневмоперитонеум. Лапароскоп вводился через установленный троакар. Для введения измерительного инструмента второй троакар устанавливался в правую подвздошную область. После этого оценивались сформированные гетеротопии и производилось измерение их продольного и поперечного размера (рис. 1). Ткани ушиты послойно узловыми швами. Выполнена интраоперационная антибиотикопрофилактика цефтриаксоном в дозе 50 мг/кг и противовоспалительная терапия по той же схеме.
После оценки гетеротопий крысы были рандомизированы в 2 группы. Группа 1 (основная, n=10) ежедневно в течение 21 дня получала мицеллярный куркумин Novasol (Solgar) в дозе 150 мг/кг перорально. Группа 2 (контрольная, n=7) получала 0,9% раствор хлорида натрия.
На втором этапе было обнаружено, что у животных сформировалось 32 гетеротопии; таким образом, формирование модели оказалось успешным в 94% наблюдений. В группе 1 (основной) у 10 крыс сформировалось 20 гетеротопий, площадью от 28,2 до 62,8 мм2, средняя площадь гетеротопий в группе 1 составила 45,2±8,8 мм2. В группе 2 (контрольной) было сформировано 12 гетеротопий площадью от 37,6 до 50,2 мм2, средняя площадь составила 49,2±7,2 мм2 (рис. 2).
Третий этап – выведение из эксперимента. Через 3 недели после лапароскопии всем животным была выполнена аутопсия, произведена оценка размера очагов (2 размера: продольный и поперечный). Затем гетеротопии были иссечены для последующего гистологического заключения. Площадь очагов фиксировалась на втором и третьем этапах эксперимента и рассчитывалась по формуле площади эллипса: S=A × B × π, где S – площадь гетеротопии (мм2), А – продольный размер (мм), В – поперечный размер (мм), π=3,14. Гистологическое исследование проводилось по стандартной методике.
Гистологическое исследование было проведено в Государственном научно-исследовательском испытательном институте военной медицины Министерства обороны Российской Федерации, Санкт-Петербург. Подготовленные гистологические микропрепараты срезов эндометриоидных гетеротопий изучали на микроскопе Zeiss Axioskop 40 (Германия), фоторегистрацию проводили при помощи цифровой фотокамеры Nicon DS-Fi3 (Япония) c базовым программным обеспечением FastStone Image.Viewer и цифровой камеры NIS-Elements 5.21.03 64-bit.
Статистический анализ
Количественные данные были описаны с помощью среднего арифметического, стандартного отклонения. Для всех числовых данных проводилось предварительное тестирование на нормальность распределения с помощью теста Шапиро–Уилка, а также теста на асимметрию и эксцесс с расчетом значения p при тестировании нулевой гипотезы о нормальном распределении переменной. В связи с тем, что основной целью исследования было определить наличие статистически значимой разницы в средней площади сформировавшихся эндометриоидных гетеротопий, в двух группах для статистического анализа применялся t-критерий Стьюдента для независимых выборок. Все приведенные значения р были основаны на двусторонних тестах значимости, различия считали статистически значимыми при р<0,05. Все статистические вычисления были проведены в Exсel.
Результаты
После трех недель ежедневного приема куркумина, по данным гистологического заключения, в основной группе наблюдалась полная резорбция 12 сформированных очагов (т.е. 60% гетеротопий); в оставшихся 8 очагах (40%) отмечен регресс. Средняя площадь гетеротопий в основной группе после курса лечения куркумином составила 7,0 (4,3) мм2. В контрольной группе через 3 недели отсутствия терапии наблюдался значительный рост очагов, и их средняя площадь составила 93,9 (11,3) мм2 (рис. 3).
Обсуждение
Полученные данные не противоречат результатам, описанным в литературе. Однако удалось найти всего несколько экспериментов с применением куркумина, и они имеют отличия от нашего исследования. В ряде работ в качестве лабораторных животных были использованы мыши, и первое из них было проведено в 2009 г. В исследовании Swarnakar S. и Paul S. отмечено, что на фоне применения куркумина наблюдается снижение инвазии гетеротопий на модели хирургически-индуцированного эндометриоза у мышей, которым интраперитонеально вводили препарат в дозах 48, 24 и 12 мг/кг [36]. На основании результатов эксперимента удалось установить дозозависимый регресс самих очагов, а также снижение уровня экспрессии ММП-9 в них. Аналогичные результаты в отношении снижения экспрессии ММП-3 были получены Jana S. et al. с использованием куркумина интраперитонеально в дозе 48 мг/кг в течение 21-го дня у мышей [37]. Другое исследование показало значимое снижение уровней провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6) и VEGF в перитонеальной жидкости мышей, а также уменьшение размеров эндометриоидных гетеротопий у животных, получавших маслянистый раствор куркумина перорально в дозе 300 мг/кг в течение 3 недель [38]. Интересный эксперимент провели Boroumand S. et al. с использованием наночастиц, соединенных с куркумином. После формирования модели эндометриоза у мышей и оценки площади образовавшихся эндометриоидных очагов наночастицы подшивались к париетальной брюшине животных. Через 21 день после терапии производилось контрольное измерение гетеротопий, которое продемонстрировало значимый регресс размера эндометриоидных очагов в группе животных, получавших куркумин [39]. Представленные выше исследования, посвященные оценке эффективности куркумина на модели эндометриоза у крыс, отличаются от нашего эксперимента, в первую очередь формой использованного препарата. Так, например, в работе Zhang Y. et al. крысы были поделены на 3 группы и получали куркумин в дозах 50, 100 и 150 мг/кг в виде суспензии с карбоксиметилцеллюлозой ежедневно перорально. По истечении 4 недель терапии было обнаружено дозозависимое влияние полифенола на снижение экспрессии VEGF в эктопическом эндометрии самок крыс [28]. Регресс эндометриоидных очагов, а также снижение экспрессии пролиферирующего антигена ядерных клеток как маркера активности клеточного деления у крыс на фоне 100 мг/кг куркумина, получаемого перорально, в течение 3 недель были продемонстрированы Kizilay G. et al. [40]. Важно отметить, что во всех работах было показано значимое уменьшение размера эндометриоидных очагов на фоне терапии куркумином, независимо от формы и дозы использованного препарата.
Заключение
Куркумин в виде высокорастворимой мицеллярной формы (Solgar) продемонстрировал высокую эффективность в терапии хирургически-индуцированного эндометриоза у крыс линии Wistar. Учитывая резорбцию или значимое уменьшение размеров эндометриоидных гетеротопий в рамках нашего эксперимента, а также установленное in vivo в многочисленных исследованиях влияние куркумина на такие патогенетические звенья эндометриоза, как подавление воспаления, снижение активности ангиогенеза и инвазии клеток, уменьшение апоптоза, а также антиоксидантное действие, можно сделать вывод о перспективности применения мицеллярного куркумина в терапии НГЭ.
