Подбор параметров культивирования эмбрионов человека имеет важное значение в развитии программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в России и за рубежом [1–4]. При культивировании в условиях эмбриологической лаборатории эмбрион находится в условиях, которые отличаются от естественных. К ним можно отнести pН среды, температуру, газовый состав среды, воздействие естественного и искусственного света [5]. В последние годы были достигнуты значительные успехи в развитии эмбриологии, в том числе связанные с оптимизацией рутинных условий культивирования эмбрионов [6–8]. Тем не менее ряд условий in vitro по-прежнему в значительной степени отличается от условий in vivo [9–12]
В организме матери сокращения стенки маточной трубы вместе с сокращениями ворсинок слизистой оболочки позволяют обеспечить динамическое взаимодействие эмбриона и его микроокружения [13–15]. Также данные процессы направлены на обеспечение диффузии питательных веществ. Все вышеперечисленное оказывает значимое влияние на преимплантационное развитие эмбриона [16, 17].
Комбинация рутинных условий культивирования эмбрионов с применением систем культивирования с контролируемой механической микровибрацией (КММВ) может стать новым подходом к повышению эффективности программ ВРТ [16, 18, 19].
Цель исследования: оценить влияние КММВ на частоту оплодотворения ооцитов и преимплантационное развитие эмбрионов.
Материалы и методы
В исследование включены 923 супружеские пары в возрасте 18–45 лет, обследованные в соответствии с приказом Минздрава Российской Федерации от 30.08.2012 №107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» [20]. В группе микровибрации была проведена оценка качества 952 эмбрионов (1119 ооцит-кумулюсных комплексов), полученных от 166 пациенток. В контрольной группе была проведена оценка качества 3369 эмбрионов (3886 ооцит-кумулюсных комплексов), полученных от 757 пациенток. Неоплодотворенные или аномально оплодотворенные ооциты не учитывали при проведении анализа (за исключением оценки частоты оплодотворения). В исследование не были включены пациентки, чьи программы включали использование донорских ооцитов.
Пациентки, включенные в исследование, не различались по возрасту (34 (31–39) против 35 (32–41) лет, p=0,69) и индексу массы тела (23,2 (3,8) против 23,3 (4,3) кг/м2 в группе микровибрации и в контрольной группе соответственно).
Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено комиссией по этике биомедицинских исследований ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
Стимуляция функции яичников проводилась по протоколу с антагонистом гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) препаратами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) или человеческого менопаузального гонадотропина. Введение антагониста ГнРГ с целью профилактики преждевременного пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) начинали при достижении лидирующим фолликулом диаметра 14 мм. Триггер овуляции вводили при достижении лидирующими фолликулами диаметра 19 мм. В качестве триггера овуляции использовали хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) (8000–10 000 МЕ однократно) или комбинацию ХГЧ с агонистом ГнРГ. Трансвагинальную пункцию фолликулов под ультразвуковым контролем проводили через 36 ч после введения триггера овуляции [21].
Эмбрионы культивировали в индивидуальных каплях культуральной среды Irvine CSC (Fujifilm, США) равного объема (25 мкл) в течение 5 дней в смешанной атмосфере N2/O2/CO2 (89/5/6%). При культивировании в условиях КММВ инкубатор MINC Benchtop Mini Incubator (COOK, США) помещали на платформу ArisTT180-s (K&S Advanced Systems Ltd, Израиль). Использовали следующие параметры: частота – 40 Гц, продолжительность 30 секунд, интервал 30 минут.
Оценивали частоту оплодотворения ооцитов, качество эмбрионов на 5-е сутки развития по классификации Гарднера [22], частоту криоконсервации и число криоконсервированных эмбрионов.
Статистический анализ
Для статистического анализа и построения графиков использовали пакет статистических программ GraphPad Prism (GraphPad Software, США). Для определения нормальности распределения использовали обобщенный тест Д’Агостино–Пирсона. Для параметрических данных рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение, использовали t-test. Для непараметрических количественных данных рассчитывали медиану и интерквартильный размах, использовали тест Манна–Уитни. Для качественных данных рассчитывали абсолютное значение и проценты, использовали точный тест Фишера, отношение шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
Частота оплодотворения в группе микровибрации составила 85,1% (952/1119) против 86,7% (3369/3886) в контрольной группе (p=0,17; ОШ=0,87; 95% ДИ=0,72–1,06).
Для оценки влияния КММВ на развитие эмбрионов первых пяти суток культивирования было проанализировано качество всех эмбрионов пятых суток развития в соответствующих группах. При детальном анализе были выявлены следующие особенности. Морулу сформировали 66,6% (634/952) эмбрионов группы микровибрации и 64,3% (2166/3369) эмбрионов контрольной группы (p=0,20; ОШ=1,11; 95% ДИ=0,95–1,29). Доля полученных бластоцист составила 43,1% в группе микровибрации и 41,9% в контрольной группе (p=0,51; ОШ=1,05; 95% ДИ=0,91–1,22).
При культивировании в условиях КММВ (табл. 1) на 1,2% повышалось число эмбрионов первой степени развития (p=0,004; ОШ=2,39; 95% ДИ=1,35–4,23) и на 0,8% – число эмбрионов пятой степени развития (p=0,08; ОШ=1,70; 95% ДИ=0,98–2,94) (табл. 2). Таким образом, можно предположить, что микровибрация оказывает положительное влияние на быстро/своевременно развивающиеся эмбрионы и отрицательное влияние на эмбрионы низкого качества. При оценке качества внутренней клеточной массы и трофэктодермы было показано, что в группе микровибрации было на 2,6% больше эмбрионов класса AA (p=0,09; ОШ=1,16; 95% ДИ=0,98–1,38) и на 1,3% больше эмбрионов класса BA (p=0,03; ОШ=1,63; 95% ДИ=1,08–2,46), чем в группе контроля (табл. 2).
У 98 (59,0%) пациенток группы микровибрации и 367 (48,5%) пациенток контрольной группы после переноса эмбриона в полость матки была произведена криоконсервация одного или нескольких эмбрионов (p=0,02). ОШ вероятности криоконсервации эмбрионов в зависимости от проведения КММВ составило 1,53 (95% ДИ 1,09–2,15). Среднее число криоконсервированных эмбрионов составило 1 (0–3) у пациенток микровибрации и 0 (0–2) у пациенток контрольной группы (p=0,003). Среднее число криоконсервированных эмбрионов у пациенток с произведенной криоконсервацией эмбрионов составило 3 (1–4) у пациенток микровибрации и 2 (1–4) у пациенток контрольной группы (p=0,052).
Обсуждение
В данном исследовании мы провели сравнительный анализ оценки частоты оплодотворения ооцитов и эмбрионального развития первых пяти суток культивирования в зависимости от условий культивирования. Пациентки, включенные в исследование, не различались по возрасту, индексу массы тела и клинико-анамнестическим данным.
В литературе присутствуют противоречивые данные о влиянии КММВ на оплодотворение ооцитов человека при культивировании в программах ВРТ [23–25]. Средняя частота оплодотворения не различалась в группах сравнения в общей когорте пациенток, включенных в исследование. Таким образом, в дальнейших исследованиях актуально изучение влияния систем культивирования на частоту оплодотворения у пациенток с низкой частотой оплодотворения и с недостаточным числом получаемых ооцитов.
Для оценки влияния КММВ на развитие эмбрионов первых пяти суток культивирования было проанализировано качество всех эмбрионов 5-х суток развития в соответствующих группах. Частота развития эмбриона до стадии морулы и бластоцисты не различалась в группах сравнения. Сходные данные были получены в исследовании Hur Y.S. et al. (2013) [26] (p < 0.05, тогда как в исследованиях Isachenko E. et al. (2010) и Isachenko V. et al. (2017) микровибрация приводила у значительному повышению качества эмбрионов [16, 27]. При культивировании в условиях КММВ повышалось число эмбрионов 1-й и 5-й степеней развития, эмбрионов классов AA и BA. Таким образом, можно предположить, что микровибрация оказывает положительное влияние на быстро/своевременно развивающиеся эмбрионы и отрицательное влияние на эмбрионы низкого качества.
Учитывая невысокую эффективность программ ВРТ в расчете на один перенос эмбриона, крайне важное значение при проведении программы ВРТ приобретает возможность криоконсервации эмбрионов высокого морфологического класса для проведения последующего криопереноса. Частота криоконсервации эмбрионов была в 1,22 раза выше в группе микровибрации по сравнению с контрольной группой. Среднее число криоконсервированных эмбрионов также было выше в группе микровибрации. Таким образом, культивирование эмбрионов в условиях КММВ позволяет повысить эффективность программ ВРТ за счет увеличения числа криоконсервированных эмбрионов.
Заключение
Применение КММВ не влияет на частоту оплодотворения ооцитов в программах ВРТ, однако позволяет оптимизировать условия культивирования эмбрионов человека и повысить эффективность эмбриологического этапа программ ВРТ. Тем не менее для рутинного применения данной методики необходимы дальнейшие исследования с проспективным дизайном и оценкой отдаленных исходов.
