На сегодняшний день проблема бесплодия остается одной из самых актуальных проблем медицины во всем мире и встречается с частотой от 9 до 18% в различных странах [1]. Увеличение частоты выявления бесплодных браков влияет не только на медицинскую сферу, но также на социальную и экономическую сферы государства [2]. Определенное место в структуре бесплодного брака занимают пациентки с низким овариальным резервом; при этом распространенность этой патологии по разным данным варьирует от 5,6 до 35,1% [3].
Овариальный резерв – клинический феномен, обусловленный возрастом, генетикой, аутоиммунными механизмами и факторами окружающей среды. Этот термин используется для описания репродуктивного потенциала и прогнозирования ответа при контролируемой стимуляции овуляции в программах вспомогательных репродуктивных технологий. В соответствии с существующей концепцией возможно развитие трех вариантов сценариев: физиологическое снижение овариального резерва с возрастом, пренатально запрограммированный низкий резерв или снижение овариального резерва в период постнатального развития, связанное с факторами внешнего воздействия или особенностями питания [4]. С клинической точки зрения в эту группу с низким овариальным резервом включены: пациентки с «бедным» овариальным ответом, с преждевременной недостаточностью яичников (ПНЯ) и женщины в позднем репродуктивном возрасте.
Снижение овариального резерва может быть связано с рядом патофизиологических механизмов. Так, одним из них на сегодняшний день признан механизм активации апоптоза в клетках гранулезы. Однако, пока до конца непонятно, есть ли прямая связь между активностью этого процесса и качеством ооцитов [5, 6].
Вторым активно обсуждаемым механизмом снижения функции яичников является дегенеративный феномен, способствующий коллапсу овариального окружения, а также разрыву молекулярной сети, контролирующей васкуляризацию [7]. Недавними исследованиями показано также, что митохондриальная функция также достоверно ассоциирована со «старением» ооцитов и снижением фертильности [8].
На сегодняшний день наиболее успешным является достижение беременности у пациенток с «бедным ответом» или яичниковой недостаточностью при помощи донорских ооцитов; но значительное большинство женщин отрицательно относятся к проведению данных программ и ищут альтернативные решения, несмотря на низкие шансы беременности при попытках использовать собственные ооциты [9].
Наиболее часто используемыми протоколами и средствами в случае «бедного» овариального ответа на сегодняшний день являются: протокол с аналогами гонадотропин рилизинг гормона; андрогены; гормоны роста; естественный цикл или модифицированный естественный цикл; высокие дозы гонадотропинов; глюкокортикоиды; коэнзим Q-10; акупунктура [9].
Текущие стратегии контролируемой стимуляции яичников фокусируют свое воздействие на растущих фолликулах; при этом «дремлющие» примордиальные фолликулы не могут быть активированы известными на сегодняшний день протоколами стимуляции [10].
Исследованиями последних лет показано, что рост фолликулов может быть активирован посредством восстановления адекватного овариального окружения [11]. Подобное воздействие возможно при использовании стволовых клеток, изолированных факторов роста и обогащенной тромбоцитами аутоплазмы (PRP).
Целью настоящего обзора явилась оценка современных возможностей, эффективности и побочных эффектов различных технологий негормональной стимуляции яичников при низком овариальном резерве.
Интраовариальная PRP-терапия (аутоплазмотерапия)
В настоящее время во многих отраслях медицины все чаще используется PRP-терапия. Доказаны противовоспалительный, анальгезирующий и регенерирующий эффекты, а также описаны механизмы стимуляции пролиферации клеток [12].
Обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) – это плазма, содержащая тромбоциты в большем количестве, чем в ней содержится в норме. В норме в крови содержится 150 000–400 000/мкл. тромбоцитов, а их концентрация в обогащенной плазме составляет более 1 000 000 /мкл. Применение PRP-терапии позволяет запустить и доставить в пораженную зону факторы роста, способствующие регенерации тканей [13].
Тромбоциты продуцируются мегакариоцитами костного мозга, которые после созревания мигрируют к эндотелиальному барьеру и высвобождают в кровоток предшественники, которые, в свою очередь, будут генерировать тромбоциты. В составе тромбоцитов имеется плазматическая мембрана, в которой содержится большая сеть рецепторов, способствующих запуску внутриклеточных механизмов, позволяющих тромбоцитам выполнять свои многочисленные функции [14].
Основными такими рецепторами являются рецепторы гликопротеина Ib и гликопротеина VI. Их роль заключается в связывании с фактором Виллебранда и коллагеном, благодаря чему происходят конформационные изменения в тромбоцитах и позволяют им связываться с фибриногеном, тканями и другими тромбоцитами, чтобы сформировать тромб. Кроме того, эта активация тромбоцитов также вызывает высвобождение их внутреннего содержимого, что необходимо для регенеративного эффекта при применении PRP [15].
Внутри тромбоцитов содержатся различные гранулы. Это плотные гранулы, α-гранулы и лизосомы. α-гранулы характеризуются более высоким содержанием активных биомолекул, связанных с восстановлением тканей. Были идентифицированы сотни таких молекул, в том числе, адгезивные белки, фибринолитические и коагуляционные факторы, антимикробные молекулы, цитокины и факторы роста. Именно цитокины и факторы роста участвуют в процессах репарации и регенерации тканей, таких, как ангиогенез, хемотаксис, миграция или пролиферация клеток [15].
На сегодняшний день описано более 30 факторов роста, содержащихся в α-гранулах тромбоцитов. Основными факторами роста являются:
- PDGF (platelet-derived growth factor) – тромбоцитарный фактор роста, отвечает за активацию миграции и пролиферации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, фибробластов, гладкомышечных клеток, остеобластов, активацию миграции моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, активацию макрофагов.
- TGF-β1 (transforming growth factor-beta1) – трансформирующий фактор роста, индуцирует синтез межклеточного матрикса, регулирует пролиферацию кератиноцитов и стимуляцию продукции коллагена.
- VEGF (vascular endothelial growth factor) – фактор роста эндотелия сосудов, стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез, лимфоангиогенез, повышает проницаемость сосудистой стенки.
- EGF (epidermal growth factor) – эпидермальный фактор роста, стимулирует миграцию кератиноцитов, пролиферацию эпителиальных, мезенхимных клеток и фибробластов, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез, регулирует продукцию коллагеназ.
- FGF (fibroblast growth factor) – фактор роста фибробластов, индуцирует пролиферацию фибробластов, стимулирует рост эндотелиальных клеток, стимулирует ангиогенез.
- IGF (insulin-like growth factor) – инсулиноподобный фактор роста, стимулирует пролиферацию фибробластов, синтез коллагена и других компонентов межклеточного матрикса (хондроитины, гиалуронаты) [16, 17].
Такое значительное содержание факторов роста играет ведущую роль в процессах восстановления и регенерации тканей. Плазматические белки крови (фибрин, фибронектин, витронектин и др.) служат в качестве каркаса при регенерации соединительной ткани и миграции эпителиальных клеток [18].
Активация тромбоцитов вызывает высвобождение их гранул, связанных с восстановлением тканей, во внеклеточную среду, где они присоединяются к циркулирующим биомолекулам в плазме. В течение 10 минут тромбоциты производят около 70% факторов роста, а в течение первого часа происходит практически полное их высвобождение. В дальнейшем около 7 дней продолжается синтез дополнительного количества факторов роста [18].
Таким образом, PRP – это множество биомолекул плазмы и тромбоцитов, которые выполняют различные функции, такие как: коагуляция, регулирование гемостаза, воспаление, регенерация тканей, защита от микроорганизмов, а также другие биологические процессы. Но стоит отметить, что весь этот терапевтический эффект во многом зависит от состава, который в свою очередь может варьировать в зависимости от способа получения плазмы.
Активация тромбоцитов осуществляется несколькими путями: экзогенным и эндогенным. Экзогенный путь активации включает в себя физические методы (например, замораживание и оттаивание плазмы), механическое воздействие (вибрация), химические методы (добавление тромбина или хлорида кальция). Эндогенный путь активации подразумевает введение PRP без какой-либо предварительной активации и заключается в физиологической активации тромбоцитов внутри организма [19].
Таким образом, PRP может быть использована в качестве инъекций сразу после активации или в качестве фибриновой мембраны-сгустка через несколько минут после добавления активатора. В этом случае и благодаря своей консистенции эта композиция может быть использована в качестве биологического и аутологичного каркаса при хирургических вмешательствах, способствующих репарации тканей [20].
До настоящего времени механизмы воздействия плазмы на яичниковую ткань остаются неизвестными. По данным ряда авторов, введение PRP достоверно увеличивает перфузию яичниковой ткани за счет повышения количества сосудистого эндотелиального фактора роста [21].
Экспериментальными исследованиями на животных показано, что введение PRP в яичники достоверно активирует фолликулярный рост и снижает интенсивность апоптоза [22].
На сегодняшний день метод интраовариальной аутоплазмотерапии является достаточно новым, и в литературе представлен всего один крупный метаанализ, посвященный обзору этих исследований [23]. Согласно проведенному анализу, лишь 4 исследования, представленные в базе данных PubMed, могут заслуживать внимания: 3 их них – квази-экспериментальные, 1 – нерандомизированное клиническое исследование. Результаты работ, на наш взгляд, сравнить достаточно сложно, поскольку технология применялась в разных возрастных группах пациенток, в том числе, у женщин в пре- и постменопаузе. Более того, были использованы различные протоколы подготовки плазмы, а также варианты и кратность ее введения.
Нами также продемонстрирована эффективность методики интраовариальной аутоплазмотерпии в определенной когорте пациенток с низким овариальным резервом и «бедным» ответом в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), которым ранее предлагалась донация ооцитов: положительное влияние интраовариального введения PRP на функциональное состояние яичников (достоверное снижение ФСГ через 2 месяца после инъекции, повышение эстрадиола через 1 месяц, увеличение количества антральных фолликулов через 2–3 месяца). Подобные изменения позволили включить пациенток в программы контролируемой индукции овуляции с получением ооцитов соответствующего качества (M II): 73,9% в группе до 35 лет и 43,8% – после 35 лет (р=0,032) [24].
Неоспоримыми преимуществами данной технологии, безусловно, является тот факт, что вводимая плазма является аутологичным продуктом, что минимизирует вероятность побочных эффектов в сравнении с потенциальным использованием гетерологичных образцов. Показано также, что введение плазмы обладает значительным положительным anti-age эффектом [24]. Однако, на сегодняшний день не существует стандартизации проведения этой процедуры, что, по-видимому, и объясняет гетерогенность получаемых результатов. Ряд данных свидетельствует о том, что концентрация PRP является ключевым фактором клеточной пролиферации и дифференцировки мезенхимальных клеток. Однако, персонифицированный подход к ведению таких пациенток, включающий оценку корректируемой патологии в случаях низкого овариального резерва, отсутствует. Также остаются неясными механизмы воздействия, кратность введения, необходимый объем вводимого вещества, а также максимальное количество возможных потенциальных инъекций [25].
Трансплантация стволовых клеток
Терапия стволовыми клетками в последние два десятилетия активно используется в ключе регенеративной медицины. Термин «стволовые клетки» используется для описания широкого спектра недифференцированных клеток человека, обладающих способностью к самообновлению, пролиферации и дифференцировке в различные органы и тканеспецифичные типы клеток. В гинекологии на сегодняшний день стволовые клетки применяются, как для регенерации эндометрия при синдроме Ашермана, так и для активации функции яичников при сниженном овариальном резерве [26, 27].
Основное количество исследований сфокусировано на использовании мультипотентных клеток и, особенно, мезенхимальных стволовых клеток, в качестве терапевтического инструмента лечения ПНЯ. Их особенные свойства включают недифференцированность, пролиферацию и способность к самообновлению. Более того, уникальный профиль мультипотентных клеток снижает опухолевые риски и повышает выживаемость стволовых клеток в организме, что способствует более эффективному и надежному лечению [28]. Кроме того, мультипотентные клетки способны модулировать иммунный ответ, а также обладают высокими противовоспалительными свойствами, продуцируя противовоспалительные цитокины, включающие семейство интерлейкинов, фактор некроза опухоли и интерферон γ. Более того, рядом исследований продемонстрировано антиапоптотическое свойство стволовых клеток, стимулирующее тканевую регенерацию [29]. Интересно, что яичники обладают способностью «привлекать» некоторые типы недифференцированных клеток из других органов и тканей, особенно, из костного мозга. Эти клетки мигрируют в яичники, активируя фолликулогенез посредством секреции ряда факторов роста и гормонов, регулирующих овариальную функцию [30].
Технология использования стволовых клеток была впервые описана 25 лет назад Sanders et al., который опубликовал ретроспективное исследование, демонстрирующее наступление самостоятельной беременности у пациенток с ПНЯ после трансплантации костного мозга [31]. Однако и на сегодняшний день эта процедура является экспериментальной. Несмотря на то, что стволовые клетки характеризуются низким иммунологическим профилем, аллогенная трансплантация может приводить к серьезным осложнениям [32]. На сегодняшний день описано 2 варианта введения стволовых клеток в яичники: субкортикальные инъекции при лапароскопии и введение в яичниковую артерию под контролем ультразвука; при этом оба метода признаны одинаково эффективными [33].
Наиболее опасным осложнением использования стволовых клеток являются риски злокачественной трансформации и метастазирования [34]. Именно поэтому, учитывая отсутствие данных о необходимом количестве и кратности введения, достаточно сложно достичь баланса между эффективностью и безопасностью.
Активация in vitro
Фолликулогенез человека – это сложный процесс, который регулируется гормонами, паракринными и аутокринными факторами происхождения ооцитов и гранулезных клеток. Из большого количества примордиальных фолликулов, располагающихся в яичнике, только некоторые инициируют рост, развиваясь до первичной стадии под контролем серин/треонинкиназы через два сигнальных пути: протеинкиназу В (Akt) и механическую мишень рапамицина (mTOR) у млекопитающих [35]. Путь Akt, или фосфоинозитид-3-киназа (PI3K)-Akt, является сигнальным трансдукционным путем, который способствует выживанию, росту и пролиферации в ответ на ооцитарные и гранулезоклеточные производные факторы. После активации примордиальные фолликулы начинают расти и переходят на первичную и вторичную стадии развития под влиянием паракринных факторов, а затем фолликулостимулирующего гормона [36].
Напротив, сдерживание роста преантральных фолликулов осуществляется ингибирующим сигнальным путем Hippo, что способствует повышению концентрации факторов роста CCN и ингибиторов апоптоза BRСA1,7, способных стимулировать рост фолликулов [37]. Поддержание и сохранение адекватного овариального резерва зависит от баланса между активирующими и ингибирующими факторами.
Экспериментальные литературные данные позволяют предположить, что не только внешние стимулы, но и сами ооциты в значительной степени управляют передачей сигналов, регулирующих набор и скорость роста фолликулов. В течение почти 100 лет было известно, что повреждение яичников может способствовать фолликулярному росту; однако только в настоящее время появилось убедительное научное обоснование указанного положения. Пионерами создания нового понимания раннего фолликулогенеза являются ученые Стенфордского университета во главе с A. Hsueh. Исследователи показали, что сигнальный путь Hippo ограничивает, а CNN факторы роста стимулируют преантральный фолликулярный рост [38].
Hippo является ведущим эволюционным сигнальным путем, контролирующим размеры органа во всех многоклеточных организмах, ингибирует пролиферацию клеток и стимулирует апоптоз (определяет дальнейшее развитие стволовых/прогениторных клеток). Сигнализация состоит из нескольких негативных регуляторов роста, действующих на каскад серин/треонинкиназы, в конечном итоге фосфорилирует и инактивирует ключевые транскрипционные коактиваторы YAP и TAZ (эффекторы Hippo-супрессорного пути, обладающие пролиферативной и онкогенной активностью). После активации и выхода из состояния покоя локальные сигналы Hippo определяют различную траекторию роста фолликулов, связанную с этим разную продолжительность их жизни (23–90 дней). Таким образом, негормональная in vitro активация позволяет воздействовать на hippo-сигнальный путь, позволяющий активировать рост «дремлющих» фолликулов. Было доказано, что нарушение пути Hippo (которое происходит при фрагментации ткани яичников) в сочетании со стимуляцией Akt путем применения ингибиторов фосфатазы и гомологов тенсина (PTEN) и/или стимуляторов PI3K, действительно способствует росту преантральных фолликулов [38].
Механобиология изучает, как физическое воздействие и изменение механических свойств клеток и тканей регулирует дифференцировку и пролиферацию, влияя на клеточную биохимию и экспрессию генов [39]. Механотрансдукция – процесс, посредством которого клетка реагирует и отвечает на механические сигналы посредством изменения состояния экстрацеллюлярного матрикса. Hippo-сигнальный путь является основой механотрансдукции [40].
В 2013 г. было введено понятие «активация in vitro» (IVA) для лечения пациенток с ПНЯ, планирующих беременность. Сутью этой процедуры является аутотрансплантация фрагментированного коркового вещества яичника [41]. В исследованиях описаны два варианта IVA:
- Drug-free – только фрагментация и имплантация ткани яичника, что приводит к прерыванию внутриклеточного сигнального Hippo-пути, повышению экспрессии факторов роста и ингибиторов апоптоза;
- Обработка яичниковой ткани активаторами AKT-пути PI3K стимуляторов и PTEN ингибиторов (с добавлением их к фрагментам в лаборатории [42]. В этом случаев требуется два лапароскопических вмешательства и есть риски повреждающего эффекта используемых субстанций [43].
В России технология хирургической активации яичников апробирована и предложена академиком Адамян Л.В. [44].
В международной литературе к 2020 г. представлены лишь 2 неконтролируемых клинических исследования эффективности drug-free IVA, включающих 11 [45] и 14 пациенток [46]. Суммируя полученные в ходе двух исследований данные, 9/25 пациенток с ПНЯ забеременели после переноса эмбрионов (соответственно, PR 36,0%). Однако, на наш взгляд, небольшое количество пациенток, включенных в неконтролируемый клинический эксперимент, пока не позволяет делать определенные выводы. Использование факторов роста в альтернативных технологиях требует подтверждения безопасности их использования.
В отличие от методик активации, описанных выше, основная часть исследований эффективности in vitro хирургической активации посвящена пациенткам с ПНЯ. При этом эффективность предложенной методики не изучена в группах с «бедным» овариальным ответом и у пациенток позднего репродуктивного возраста. Наше мнение совпадает с рядом авторов, считающих, что подобные технологии требуют дальнейших исследований, особенно, в ключе онкогенных рисков [43]. Известно, что повреждения PTEN-PI3K-Akt пути ассоциированы с большим количеством онкологических заболеваний, включающих в том числе, рак яичников и фаллопиевых труб [47, 48].
Заключение
Таким образом, обзор литературных данных позволил выделить три основные обсуждаемые методики негормональной стимуляции функции яичников, исключая способы альтернативной медицины: интраовариальную PRP-терапию, использование стволовых клеток и in vitro хирургическую активацию. Общий принцип воздействия представленных технологий предполагает активацию «дремлющих» примордиальных фолликулов за счет изменения овариального окружения, снижения активности апоптоза, активации микроцирукуляции и усиления hippo-сигнального пути в случае хирургической активации. Ни для одной из обсуждаемых технологий на сегодняшний день неизвестны точные механизмы воздействия. Гетерогенность дизайнов исследований и особенности анализа данных пока не позволяют точно судить об эффективности каждой из них. На наш взгляд, учитывая проведенный подробный анализ литературных данных, наиболее перспективным и, что особенно важно, безопасным, является использование аутологичной плазмы (интраовариальной PRP-терапии). Однако особенности технологии и ее результативность в различных когортах пациенток требуют дальнейшего тщательного изучения.
