Беременность является завершающей точкой в программе лечения с помощью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Однако не всем женщинам удается достигнуть этого результата с первой попытки. Проблема повторных неудачных имплантаций считается одной из самых сложных для преодоления в практике репродуктолога. Имплантация эмбриона состоит из этапов оппозиции (ориентации), адгезии и инвазии. Наступление беременности возможно только при синхронном взаимодействии бластоцисты высокого качества с рецептивным эндометрием. Наиболее благоприятное время для адгезии и инвазии бластоцисты – это период так называемого «окна имплантации» соответствующий 7–8-му дню после пика лютеинезирующего гормона (ЛГ+7-8).
Эффективность программ ВРТ в расчете на цикл стимуляции составляет 31,5%, на цикл переноса размороженных эмбрионов – 36,9% [1]. Нарушение рецептивности эндометрия выявляют в 2/3 случаев неудачных имплантаций у женщин, планирующих беременность самостоятельно или с помощью ВРТ; в 1/3 случаев за неудачу отвечает эмбрион. Поэтому вопрос идентификации максимальной восприимчивости эндометрия к нидации эмбриона на сегодняшний день представляет большой интерес.
Гистологическое исследование длительное время оставалось «золотым стандартом» оценки рецептивности эндометрия. R.W. Noyes были разработаны критерии оценки ткани эндометрия в зависимости от фазы менструального цикла, в том числе и в период предполагаемого «окна имплантации» [2].
Однако в более поздних исследованиях было показано, что гистологическое заключение скорее позволяет судить о произошедшей овуляции, чем о рецептивных свойствах эндометрия.
Подвергнутые сомнению критерии Noyes обосновали необходимость поиска новых маркеров имплантационного эндометрия. Следующими наиболее изученными морфологическими маркерами рецептивности эндометрия являются пиноподии. A. Zhioua и соавт. (2012), изучая эндометрий средней фазы стадии секреции с помощью электронной микроскопии, провели анализ клеточных компонентов, составляющих эпителий эндометрия. Авторы описали 4 типа клеток, которые идентифицируются в разных пропорциях в эндометрии. Только пиноподии были выявлены на протяжении всего периода «окна имплантации» [3]. Пиноподии – это микровыросты на поверхности эндометрия, которые появляются с середины лютеиновой фазы, когда происходит увеличение уровня прогестерона. Хотя роль пиноподий остается до конца неясной, показано, что именно на поверхности пиноподий локализуются основные рецепторы для адгезии и инвазии бластоцисты. Однако, существуют исследования, которые продемонстрировали, что появление пиноподий не всегда может быть использовано в качестве адекватной оценки рецептивного статуса эндометрия [4]. Поэтому, поиски новых методов исследования оценки предикторов «окна имплантации» были продолжены.
Исследования имплантационного эндометрия с помощью иммуногистохимического окрашивания (ИГХ) были проведены еще в 90-х годах. Эндометрий подвергается циклическим изменениям под действием стероидных гормонов. Эстрогены и прогестерон оказывают воздействие опосредовано через рецепторы прогестерона и эстрогена. Известно, что рецепторы эстрогенов и прогестерона в эндометрии в период «окна имплантации» в клетках эпителия исчезают, а в строме их количество остается крайне высоким. В то же время, исчезновение рецепторов в клетках эпителия совпадает с самыми высокими значениями уровней прогестерона и эстрадиола в крови женщин в течение менструального цикла, что способствует появлению на поверхности этих клеток белков клеточной адгезии и увеличению чувствительности эндометрия к факторам роста.
Е.В. Дюжева и соавт. (2011), М.М. Левиашвили и соавт. (2012) исследовали рецепторы эстрогенов и прогестерона и изменение экспрессии лейкемия ингибирующего фактора (LIF) у женщин с безуспешными попытками ЭКО с помощью ИГХ. Авторы сделали выводы о том, что в исследуемых группах в период «окна имплантации» имеется дисбаланс рецепторов эстрогенов и прогестерона в клетках эпителия, а также отмечается выраженное снижение LIF. У пациенток группы контроля была отмечена умеренная экспрессия LIF и нормальное соотношение рецепторов с 20–22-го дня менструального цикла. Таким образом, отсутствие беременности у таких женщин, возможно, было связано с нарушением рецептивности эндометрия к половым стероидам [5, 6]. Следует заметить, что ИГХ является довольно субъективным методом и во многом зависит от специалиста, проводящего оценку ткани эндометрия.
В качестве маркеров имплантации были предложены интегрины. Интегрины – это гликопротеины, расположенные на поверхности клеток. Они участвуют в связывании экстрацеллюлярного матрикса и регулируют процессы взаимодействия между клетками и между матриксом и клетками. Интегрины состоят из 2 субъединиц. В эндометрии установлена экспрессия следующих молекул α1, α4, αvβ3. В проспективном нерандомизированном исследовании С. Coughlan и соавт. (2013) проведено сравнение экспрессии интегринов в биоптатах эндометрия у пациенток с повторными неудачными имплантациями и фертильных женщинах. С января 2010 года по июль 2011 год были обследованы 45 женщин с неудачами имплантации и 6 фертильных пациенток. Участницам исследования была произведена пайпель-биопсия эндометрия на 7 или 9 дни после пика ЛГ. Полученные образцы были оценены с помощью ИГХ. Установлена более высокая экспрессия интегринов α1, α4 в клетках поверхностного и железистого эпителия и в клетках стенок сосудов. Экспрессия αvβ3 напротив была выше в строме. Однако не было выявлено статистически значимой разницы между экспрессией интегринов у пациенток с повторными неудачными имплантациями и группой контроля. Также не было установлено разницы в экспрессии у пациенток с наступившей беременностью (n=21) и не наступившей беременностью (n=24) после проведения цикла ЭКО. Таким образом, изучение экспрессии интегринов не позволило оценить их прогностическую ценность для наступления беременности у пациенток с повторными неудачными имплантациями [7].
Исследования LIF в качестве маркера рецептивности эндометрия продолжаются с 1992 года. LIF продуцируется эндометрием на протяжении всего менструального цикла с резким увеличением в среднюю и позднюю секреторную фазу. LIF – это многофункциональный гликопротеид, относящийся к семейству интерлейкина-6. ЛИФ взаимодействует со специфическими рецепторами, расположенными на поверхности бластоцисты LIF-R. J.M. Franasiak (2014) исследовали изменение экспрессии LIF и интегрина αvβ3 у женщин с бесплодием неясного генеза. Авторы пришли к выводу, что у пациенток исследуемой группы снижена экспрессия и LIF и интегрина αvβ3 в среднюю секреторную фазу. Поэтому для оценки восприимчивости эндометрия лучше использовать оба маркера [8].
Исследование случай-контроль, проведенное в период с 2013 по 2015 г посвящено изучению изменения экспрессии LIF и LIF-R у 45 женщин (15 фертильных и 30 бесплодных пациенток) в период «окна имплантации». Экспрессия LIF и LIF-R достоверно снижалась в эпителиальных клетках бесплодных женщин (Р=0,05 и Р=0,006 соответственно). Однако не было обнаружено существенных различий в отношении экспрессии LIF в стромальных клетках (P=0,95). К тому же, экспрессия LIF-R была относительно выше в стромальных клетках фертильной группы, однако разница не достигла статистической значимости (P=0,10). В заключение, эндометриальная экспрессия LIF и LIF-R значительно снижается в эпителиальных клетках бесплодных женщин [9]. Модели экспрессии LIF-R в стромальных клетках требуют дальнейших исследований для достижения окончательных результатов.
Учитывая весьма разноречивые данные о роли вышеописанных маркеров рецептивности эндометрия, развитие молекулярно-генетических методов изучения экспрессии генов, выполняющих различные функции в процессе имплантации, позволило получить новую обширную информацию о рецептивном эндометрии.
Благодаря появлению так называемых «omics», были проведены крупномасштабные сравнения паттернов экспрессии генов в клетках и тканях в различных клинических условиях. В репродуктивной медицине это способствовало «всплеску» работ, посвященных изучению молекулярных изменений в клетках эндометрия в разные периоды менструального цикла [10–14].
C. Shi и соавт. (2017) проводили сравнение изменения экспрессии генов у пациенток с повторными неудачными имплантациями (n=12) и пациенток бесплодием (n=10), беременность у которых наступила после первой попытки ЭКО. В результате проведенного исследования было выявлено выраженное изменение экспрессии 105 генов. Авторы сделали вывод, что именно эти гены могут способствовать нарушению имплантации у пациенток с повторными неудачами попытками ЭКО [14].
На сегодняшний день имеются тест-системы, предложенные к практическому применению, которые позволяет определить рецептивный статус эндометрия у пациенток, проходящих лечение в программе ЭКО [15].
«Endometrial Receptivity Array» (ERA) – это система микроматричного анализа (микрочип), включающая 238 генов. С помощью этого теста, по утверждению авторов, можно определить персональное «окно имплантации» в течение менструального цикла, перед проведением переноса размороженных эмбрионов у пациенток с повторными неудачами ЭКО[15]. В соответствии с данными, представленным в исследовании, чувствительность и специфичность теста составляют 99 и 88%. Тест ERA рекомендуется применять, как в естественных циклах (ЛГ+7), так и в циклах заместительной гормональной терапии (на 5-й день применения прогестерона) [16].
В исследовании 2013 г. принимали участие 85 пациенток с повторными неудачными имплантациями в анамнезе (4,8±2,0 после переноса эмбрионов в стандартном протоколе) и 25 пациенток группы сравнения. Всем женщинам была произведена биопсия эндометрия на 7-й день пика ЛГ в естественном цикле (ЛГ+7) и на 5-й день приема прогестерона у пациенток, получавших заместительную гормональную терапию. При помощи системы ERA у части из них были получены результаты о наличии рецептивности эндометрия или ее отсутствии в день проведения биопсии. В случае положительного результата был произведен перенос эмбриона в соответствующий день цикла. При отрицательном результате женщинам проводили повторные биопсии эндометрия до момента получения положительных данных. После чего производился перенос эмбрионов в день положительного результата [17].
При использовании системы ERA установлено, что положительный результат был выявлен у 74,1% женщин с повторными неудачными имплантациями и у 88% женщин из контрольной группы. 29 пациенткам с неудачными имплантациями был произведен перенос эмбриона с учетом определения персонального «окна имплантации», в результате чего беременность наступила в 51,7% случаев. Отрицательный результат был установлен у 22 женщин из основной группы и у 15 из них после повторного определения рецептивности эндометрия было выявлено смещение «окна имплантации». 8 женщинам был произведен перенос эмбрионов с учетом полученных результатов, у 50% из них наступила беременность.
Авторы пришли к следующим выводам: у пациенток с повторными неудачными программами ВРТ существует риск смещения «окна имплантации», поэтому необходимо придерживаться концепции определения наиболее оптимального дня переноса эмбрионов, что положительно влияет на частоту наступления беременности [17].
Продолжая исследования в 2014 году M. Ruiz-Alonso и соавт. показали, что период «окна имплантации» с 19-го по 21-й день менструального цикла не является универсальным для всех женщин. Исследователи сделали заключение, что у каждой четвертой пациентки с безуспешными попытками ЭКО, происходит смещение «окна имплантации» на 2 дня, вероятно, это и является причиной неудачных имплантаций [18].
В то же время, оценка экспрессии 238 генов является достаточно трудоемкой, дорогостоящей и, по-видимому, избыточной для рутинной клинической практики, поэтому существует необходимость определения меньшего числа прогностических биомаркеров восприимчивости эндометрия, что обуславливает целесообразность продолжения исследований в этом направлении.
М.А. Маслова и соавт. изучали профили экспрессии генов в период «окна имплантации» в цикле перед проведением лечения с помощью ВРТ. В исследовании приняли участие 121 пациентка с трубно-перитонеальным фактором бесплодия. В соответствии с результатами морфологического исследования все пациентки были разделены на 2 группы: в I группе (n=55) эндометрий соответствовал ранней стадии секреции, ко II группе (n=62) были отнесены пациентки, у которых была выявлена средняя стадия секреции. По данным анализа экспрессии 36 генов установлены достоверные различия в экспрессии мРНК следующих генов у пациенток с наступившей биохимической и клинической беременностью по сравнению с пациентками, у которых беременность не наступила: матриксная металлопротеиназа (MMP)-7, сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF)-A, интерлейкин (IL)-1b, IL-2, IL-8, IL-18, фактор некроза опухоли (TNF)-a, IL-10, трансформирующий фактор роста (TGF)-b – в раннюю стадию секреции экспрессии; инсулиноподобный фактор роста связывающий протеин (IGFBP)2 – в среднюю стадию секреции [19].
О.В. Бурменская и соавт. провели гистологическое исследование и определение транскрипционного профиля генов (GPX3, PAEP, DPP4, TAGLN, HABP2, IMPA2, AQP3, HLA-DOB, MSX1, POSTN) методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени биоптатов эндометрия в естественном цикле. В исследование включена 71 женщина без патологии эндометрия с реализованной репродуктивной функцией, из них 47 женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия – с помощью программы ЭКО и 24 условно здоровые женщины. В результате исследования оценивались изменения уровня экспрессии мРНК в рецептивном эндометрии по сравнению со стадией ранней секреции. После проведенного анализа в результате значительного изменения экспрессии следующие гены были предложены к практическому применению: PAEP, DPP4, MSX1 и HLA-DOB [20].
В 2013 году на основании мета-анализа работ в период с 2002 по 2011г была разработана база данных Human Gene Expression Endometrial Receptivity database (HGEx-ERdb), посвященная оценке молекулярно-генетического фенотипа эндометрия в различные фазы менструального цикла на основании информации более чем о 19 000 генах. С помощью этой базы данных можно найти информацию о статусе интересующего гена в разные периоды естественного менструального цикла, а также при проведении гормональной терапии. Кроме того, на основании работ, оценивающих экспрессию генов в период «окна имплантации» с 2002–2006 года, были выделены 179 генов, ассоциированных с рецептивностью эндометрия (Raceptivity Associated Genes). Основанием для выделения этих генов послужили достоверные различия в их экспрессии с 20 по 24 дни менструального цикла (повышение экспрессии 151 гена и снижение экспрессии 28 генов). Таким образом, эта база представляет собой ценный ресурс для изучения вопроса о возможных предикторах «окна имплантации» [21, 22].
Заключение
Имеющиеся на сегодняшний день исследования транскриптомного профиля экспрессии генов эндометрия, пока не могут решить проблему повторных неудачных имплантаций и дать четкие критерии открытия и закрытия «окна имплантации». Поэтому необходимо проведение дальнейших научных исследований, направленных на более детальное изучение проблемы рецептивности эндометрия для приближения к пониманию механизмов синхронного взаимодействия эмбриона и эндометрия.
