В последнее время широко распространены исследования, посвященные изучению роли фолиевой кислоты в патогенезе осложнений гестации [1].
На сегодняшний день не вызывает сомнений, что фолиевая кислота относится к важнейшим микронутриентам, участвующим в формировании тканей и органов плода в критические периоды беременности. Недостаточность фолатов во время беременности ассоциирована с такими осложнениями, как пороки развития, задержка роста плода, привычный выкидыш, антенатальная гибель плода, преждевременная отслойка плаценты и преждевременные роды [1–3].
По данным современных исследований, большинство людей потребляют с пищей недостаточное количество фолатов [3, 4]. Рекомендации для беременных и родильниц предусматривают суточное потребление фолатов в дозе от 400 до 800 мкг [1, 3]. Однако степень всасывания и утилизации фолатов и фолиевой кислоты не всегда зависит от характера потребляемой пищи. Способ приготовления и состояние желудочно-кишечного тракта могут напрямую влиять на степень усвоения фолиевой кислоты, так же как и некоторые лекарственные препараты (противовоспалительные средства, антиметаболиты фолиевой кислоты, гипогликемические, диуретические и сульфаниламидные препараты) [2, 5, 6].
Работы ряда авторов свидетельствуют о влиянии генетических факторов в развитии патологических состояний в период гестации. Так полиморфизмы генов фактора некроза опухоли-α, интерлейкина-6, интерлейкина-10 ассоциированы с высоким риском развития преэклампсии, метаболического и респираторного дистресс-синдрома плода. Развитие же плацентарной недостаточности (ПН) и задержка роста плода (ЗРП) ассоциированы с полиморфизмом целого ряда генов, одним из которых выступает метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) [7, 8].
Фермент MTHFR играет ключевую роль в метаболизме фолиевой кислоты и синтеза ДНК, обеспечивая превращение аминокислоты гомоцистеин в метионин. Снижение уровня активности фермента MTHFR приводит к накоплению гомоцистеина в плазме и отложению гомоцистеина на эндотелии сосудов [5, 9, 10]. На сегодняшний день установлено, что регуляция активности фермента обусловлена рядом полиморфизмов гена MTHFR. Клинические проявления данной зависимости выражаются в целом ряде патологических состояний гестационного процесса [11–14]. Особый интерес представляют исследования, посвященные полиморфизму гена MTHFR: 677 C>T (Ala222Val).
В последние годы установлена связь между недостатком фолиевой кислоты и патологией плаценты, потребность которой в данном витамине избирательно высока. Увеличивается риск плацентарного кровотечения, отслойки плаценты, преждевременных родов, рождения детей с задержкой роста [11, 15].
В то же время в ряде исследований показано, что дополнительный прием фолиевой кислоты благоприятно влияет на течение беременности и массо-ростовые показатели плода [12, 15].
Цель исследования: определение роли полиморфизма гена MTHFR в формировании синдрома задержки роста плода.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 248 беременных (случай-контроль), разделенных на 2 группы: В I группу были включены беременные с ЗРП – 100 пациенток. Во II группу – 148 беременных без признаков ЗРП. На II этапе были изучены полиморфизмы генов MTHFR с выделением зависимости с развитием ЗРП. На III этапе ретроспективно на основании изучения данных анамнеза, была проведена оценка влияния приема препаратов фолиевой кислоты в период гестации и частоту развития ЗРП.
Выделение ДНК проводили по методу R. Higuchi (R. Higuchi, H. Erlich, 1989) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, с EDTA в качестве антикоагулянта, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5 мл лизирующего раствора, состоящего из 0,32 М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течение 1 мин при 10 000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза отмывали указанным буфером. Концентрация ДНК определенная на ДНК-минифлуориметре («Ноеfer», США) составляла в среднем 50–100 мкг/мл. Определение замен одиночных нуклеотидов проводили модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотиды. Определение генотипа проводили путем анализа кривых плавления. Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Выполнено определение полиморфных локусов гена MTHFR: 677 C>T (Ala222Val).
Все полученные результаты наблюдения и обследования вносились в специально разработанную тематическую карту и в электронные таблицы MS Excel. Статистическая обработка полученных результатов была проведена на персональном компьютере при помощи программного пакета SPSS Statistics 17.0 for Windows. При оценке достоверности выявленных различий между средними значениями выборок и достоверности выявленной корреляции рассчитывалась вероятность ошибки р. По общепринятой терминологии в аналитической статистике утверждения, имеющие вероятность ошибки р≤0,05, называются значимыми; утверждения с вероятностью ошибки р≤0,01 – очень значимыми, а утверждения с вероятностью ошибки р≤0,001 – максимально значимыми. Для определения статистической значимости различий частот аллелей и генотипов в группах больных применялся критерий χ2. Анализ неравновесности сцепления проводился с помощью свободно-распространяемого продукта Haploview версии 4.2. Подготовка данных для анализа осуществлялась с помощью SNP_tools версии 1.61 – свободно распространяемого расширения для MS Excel. Статистическая обработка данных проводилась с помощью свободно распространяемого программного продукта WINPEPI версии 10.7.
Результаты исследования и обсуждение
В соответствии с поставленными целью и задачами на I этапе исследования был проведен анализ акушерско-гинекологического и соматического здоровья беременных, наблюдавшихся и родоразрешенных в ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Подробно изучены особенности анамнеза, исходной клинической характеристики, течения беременности, родов и послеродового периода у пациенток с ПН, проанализированы особенности течения раннего неонатального периода. При изучении раннего неонатального периода учитывались массо-ростовые показатели новорожденных, оценка состояния по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах.
Возраст беременных, включенных в исследование, колебался от 18 до 45 лет и составил в среднем 30,9±0,9 и 29,0±0,8 года соответственно по группам. У пациенток I группы среди cоматических заболеваний превалировал пролапс митрального клапана – 19,0% (OR=0,5; CI=0,2–0,8), варикозная болезнь – 23,0% (OR=0,5; CI=0,3–0,8), миопия с астигматизмом – 20,0% (OR=0,5; CI=0,3–0,9), остеохондроз – 31,0% (OR=1,5; CI=1,3–1,8), сколиоз – 49% (OR=0,16; CI=0,04–0,58). Среди гинекологических заболеваний в данной группе пациенток чаще встречалась дисфункция яичников – 7,0% (OR=2,6; CI=1,1–6,4).
Течение настоящей беременности в I триместре у пациенток I группы чаще осложнялось рвотой беременных легкой или умеренной – 32,0% (OR=13,5; CI=18,2–24,5), угрожающим абортом – 48,0% (OR=3,5; CI=1,4–11,2) с формированием ретрохориальной гематомы – 7,0% (OR=5,5; CI=1,2–27,3). В течении II триместра у пациенток I группы также чаще отмечались угрожающий аборт и угрожающие очень ранние преждевременные роды – 36,0% (OR=4,8; CI=2,6–8,9); при этом в 4,0% случаев проводилась хирургическая коррекция истмико-цервикальной недостаточности. Течение III триместра беременности у пациенток данной группы осложнялось угрожающими преждевременными родами – 25,0% (OR=3,3; CI=1,6–6,4), гипоксией плода – 26,0% (OR=5,2; CI=2,4–10,9). Дети от матерей I группы имели достоверно более низкие показатели массо-ростового коэффициента и более низкую оценку при рождении по шкале Апгар.
На II этапе у беременных всех групп были изучены полиморфизмы гена MTHFR и определена их зависимость с развитием ЗРП. При изучении полиморфизма гена MTHFR (677 C>Т) при ЗРП частота встречаемости аллеля С была статистически значимо ниже, чем в контрольной группе, а генотип С/С не был выявлен ни у одной пациентки. Данные молекулярно-генетического исследования обосновывают целесообразность применения фолиевой кислоты (в соответствии с одобренным режимом применения: 5 мг в течение I триместра беременности) у пациенток группы риска по развитию плацентарной недостаточности.
На III этапе был проведен ретроспективный анализ изучения данных анамнеза с оценкой влияния приема препаратов фолиевой кислоты в период гестации и частоты развития задержки роста плода.
Из 248 беременных, включенных в исследование, 150 женщин получали препараты, содержащие фолиевую кислоту по 5 мг в сутки в течение I триместра беременности. В I группе 70% беременных дополнительно получали препараты фолиевой кислоты ввиду отказа остальных 30% пациенток от приема дополнительных «ненужных препаратов». Во II группе 80% женщин включили в ежедневный рацион дополнительный прием препаратов фолиевой кислоты.
На основании полученных данных статистически значимой зависимости между ЗРП и приемом фолиевой кислоты в обеих группах получено не было. Однако при учете в модели носительства полиморфизма гена MTHFR (677 C>Т) (по данным молекулярно-генетического исследования) с приемом препаратов фолиевой кислоты, установлена корреляционная связь отказа от приема фолатов с развитием ЗРП.
Тромбофилические состояния (антифосфолипидный синдром, гипергомоцистеинемия, мутации генов MTHFR, V фактора и протромбина) являются одной из важных причин невынашивания беременности и ЗРП. Они приводят к нарушению фибрин-опосредованной имплантации оплодотворенной яйцеклетки в децидуальную ткань, а также связаны с тромбообразованием в сосудах плаценты, приводя к нарушению жизнедеятельности имплантировавшегося плодного яйца, а на более поздних сроках беременности – плода [9, 14, 15].
На основании проведенного исследования были выделены значимые клинические факторы риска развития ПН: миопия с астигматизмом, пролапс митрального клапана, варикозная болезнь, остеохондроз, сколиоз. К предрасполагающим факторам развития ПН следует относить: угрожающий аборт в I триместре с формированием ретрохориальной гематомы, истмико-цервикальную недостаточность. Установлены неинвазивные предикторы формирования ПН (полиморфизм генов MTHFR), которые следует определять у беременных группы риска. При наличии полиморфизма гена MTHFR целесообразно применение фолиевой кислоты в I триместре беременности по 5 мг в сутки для профилактики развития ЗРП.
На сегодняшний день на фармацевтическом рынке представлен препарат фолацин (держатель регистрационного удостоверения ЗАО «Фармацевтический завод ЭГИС»), включающий оптимальный состав для приема на этапе планирования и во время беременности пациенткам с высоким риском развития дефектов нервной трубки у плода. Фолацин является современным лекарственным препаратом, действующим веществом которого является фолиевая кислота.
Препарат обладает следующими достоинствами: хорошая переносимость, невозможность передозировки и отравления лекарством, быстрое наступление терапевтического эффекта. Передозировка практически невозможна, поскольку усваивается столько фолиевой кислоты, сколько нужно организму, а избыток витамина выводится почками, не причиняя вреда. Некоторые побочные эффекты препарата имеются. В редких случаях у женщин могут наблюдаться тошнота, отсутствие аппетита, вздутие живота, отрыжка воздухом, кожный зуд, головокружение, проходящие самостоятельно при отмене приема препарата.
Заключение
Таким образом, вышеизложенное позволяет рекомендовать препарат фолацин в профилактических целях у беременных, входящих в группу риска реализации ЗРП, носителей полиморфизма гена MTHFR (677 C>Т). Своевременное начало приема данного препарата у обследованного контингента пациенток позволит снизить частоту развития ЗРП, улучшить перинатальные исходы.
