Липиды выполняют множество функций в качестве источника энергии, основного структурного компонента плазмы и мембран органелл, сигнальных молекул и компонента сложных белков липопротеинов [1, 2]. С развитием технологий масс-спектрометрии, спектроскопии ядерного магнитного резонанса, флуоресцентной спектроскопии и вычислительных методов стало возможным исследование метаболома, в том числе липидома, с описанием полного липидного профиля в клетке, ткани или организме. Липидомные исследования позволяют выявить зависимость биохимических механизмов, участвующих в изменениях клеточного липидного метаболизма, транспорта и гомеостаза. Уже была признана роль липидов в развитии многих метаболических заболеваний, таких как ожирение, атеросклероз, инсульт, гипертония и диабет, которые вызывают значительные изменения организма и оказывают негативное влияние на здоровье человека [3, 4].
Липидом и женская репродукция
Метаболомика может быть использована в репродуктивной медицине для выявления и количественного определения низкомолекулярных метаболитов (в частности липидома), которые присутствуют в фолликулярной жидкости (ФЖ). ФЖ является важной составляющей для роста и развития ооцитов и синтезируется за счет компонентов клеток гранулезы путем транспорта веществ из кровеносных сосудов [5], являясь основной средой для внутриклеточных взаимодействий. Тщательная идентификация липидов, цитокинов, факторов роста, электролитов, антиоксидантов и других молекул может улучшить существующее понимание передачи внутриклеточного сигнала и выявить потенциальные биомаркеры качества ооцитов [1, 6–9]. Липиды, в свою очередь, оказывают прямое влияние на рост и созревание ооцитов, а в последующем и на процесс фертилизации и качества эмбрионов, и могут быть предложены в качестве неинвазивных маркеров качества ооцитов [1, 7, 10, 11].
Метаболический состав ФЖ подвергается изменениям в течение жизни человека. Такие факторы, как старение и индекс массы тела (ИМТ), тесно связаны с женской фертильностью, оказывая влияние на энергетический и липидный обмен [1, 12, 13]. Исследование, проведенное Zhang X. et al. в Китае, было направлено на выявление взаимосвязи липидного профиля ФЖ, возраста и репродуктивной функции [6]. Доказано, что состав ФЖ меняется с возрастом, что может быть важной причиной старения ооцитов. Был изучен метаболомный анализ образцов ФЖ 230 пациенток, проходящих лечение методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Все пациентки были разделены на 4 группы: 1-я группа (А) включала 54 пациентки в возрасте 21–27 лет, во 2-ю группу (Б) были включены 85 пациенток в возрасте 28–34 года, в 3-ю группу (С) включили 51 пациентку в возрасте 35–41 год, 4-я группа состояла из 40 пациенток в возрасте 42–48 лет. Процент полученных ооцитов, оплодотворения и переноса эмбрионов статистически значимо уменьшался с увеличением возраста пациенток, однако не было достоверных различий в частоте получения эмбрионов отличного качества в разных возрастных группах. У пациенток старшего репродуктивного возраста (3-й и 4-й групп) было зарегистрировано большее количество таких метаболитов, как арахидоновая кислота, лизофосфатидилхолины LysoPC (16:1), LysoPC (20:4), LysoPC (20:3), в то время как количество лизофосфатидилхолинов LysoPC (18:1), лизофосфатидилхолинов LysoPC (18:3) уменьшалось. Известно, что арахидоновая кислота потенциально индуцирует апоптоз через общий путь высвобождения цитохрома С из митохондрий, предполагают, что данный метаболит играет роль в созревании фолликулов. Лизофосфатидилхолин (LPC) может активировать несколько вторичных мессенджеров; киназы, протеинкиназу С, которые участвуют в регуляции развития фолликулов и созревания ооцитов [14, 15]. LPC может влиять на окислительную способность митохондрий посредством синтеза кардиолипина, который является важным компонентом митохондриальных мембран [11]. В данном исследовании остается открытым вопрос корреляции данных метаболитов ФЖ с метаболитами в самих ооцитах. Возможно, проведение дальнейших исследований поможет уточнить патогенез внутриклеточных взаимодействий в микроокружении ооцита и определить возможные вмешательства по улучшению качества полученных ооцитов в программах ВРТ [6, 16].
В клиническом исследовании Ruebel M.L. et al. показано, что женщины с ожирением имеют повышенные уровни триглицеридов (ТГ), лептина и С-реактивного белка в ФЖ, которые коррелируют с более низким качеством ооцитов и отрицательными исходами беременности [17]. У женщин с ожирением повышенное содержание липидов может способствовать внутриклеточному окислительному стрессу, что, в свою очередь, опосредует липотоксичность: нарушение мейотического созревания и формирования веретена деления в развивающемся ооците и раннюю гибель эмбрионов [2, 18–20]. В основу определения групп исследования был положен процент жира в организме (порог отсечки в 35%). Наблюдалась тенденция к снижению уровня липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и повышению уровня ТГ в сыворотке крови пациенток с ожирением. К самым сильным предиктивным молекулам ожирения были отнесены: мочевая кислота, аминомалонат, 2-кетоглюкоза диметилацеталь, изофталевая кислота [17]. Изменения содержания данных метаболитов указывают на высокие уровни окислительного стресса и снижение антиоксидантной способности в ФЖ у женщин с избыточной массой тела. Результаты этого исследования демонстрируют, что избыточный вес влияет на метаболическую характеристику ФЖ у человека.
Изучение липидомного анализа состава ФЖ представляло интерес при сравнении различных схем стимуляции суперовуляции. Так, было проведено исследование по детекции различных липидов у 2 групп пациенток: в 1-й группе стимуляция яичников проводилась препаратами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГ); во второй группе – рФСГ+человеческий менопаузальный гонадотропин. В 1-й группе была выявлена повышенная экспрессия липидов из категорий жирных ацилов, глицерофосфолипидов и глицеролипидов. Липиды с разветвленными жирными кислотами обладают метильным разветвлением, которое увеличивает текучесть липидных бислоев за счет уменьшения толщины бислоя, снижения конденсации липидов и снижения упорядоченности цепи [21]. Было обнаружено большое количество жирных кислот и ТГ в обеих группах пациенток, что предполагает накопление жирных кислот в форме ТГ. Липидные капли ТГ обеспечивают защиту от липотоксичности, поддерживают баланс между пролиферацией и апоптозом [22]. В то же время в исследованиях in vitro более высокая концентрация свободных жирных кислот в среде для роста ооцитов может вызвать значительное увеличение нейтральных липидов и опосредовать неблагоприятное воздействие в дальнейшем на развитие эмбриона (снижение количества бластоцист). Были проведены исследования на ооцитах животных по коррекции количества насыщенных жирных кислот путем добавления сбалансированного количества пальмитиновой (C16), стеариновой (C18) и олеиновой кислот в процессе созревания ооцитов in vitro [21].
Стимуляция яичников препаратами с добавлением лютеинизирующего гормона (ЛГ) способна вызывать изменения липидного профиля по сравнению с использованием препаратов ФСГ, в основном из-за наличия сфинголипидов. Уровни простагландинов (ПГ) естественным образом увеличиваются при всплеске ЛГ в середине цикла, приводя к разрыву фолликула. Нарушение продукции ПГ Е2 или экспрессии рецептора способно предотвратить овуляцию. Экзогенный ЛГ имитирует физиологическое связывание с рецептором ПГ Е2 на периовуляторном фолликуле. Так, у молодых женщин с удовлетворительным уровнем эндогенных гонадотропинов функции ПГ Е2 могут быть усилены за счет добавления ЛГ, что потенцирует овуляцию. Учитывая, что апоптоз связан с естественной атрезией фолликулов, можно предположить, что во 2-й группе сравнения наблюдается усиленный процесс апоптоза, который регулирует созревание ооцитов и приводит к получению оптимального количества ооцитов в цикле стимуляции [21].
Группа исследователей под руководством Shehadeh A. выявила липидные молекулы ФЖ, коррелирующие с положительными исходами программ ВРТ [2]. Была обнаружена корреляция между наступлением беременности и наличием фосфолипидов (в том числе сфингомиелина), лизофосфолипидов и производных витамина D. Высокие уровни триацилглицеридов (ТАГ), диацилглицеридов (ДАГ) и эфиров холестерина у пациенток связаны с отрицательным исходом беременности. Накопление ТАГ в ФЖ также коррелировало с уровнями адипокинов и провоспалительных цитокинов в ФЖ, что указывает на воспалительные процессы в ФЖ [2]. Похожие данные получила в своих наблюдениях группа авторов под руководством Montani D.A. в результате анализа ФЖ 62 пациенток, подвергшихся лечению методами ВРТ. Уровни фосфатидной кислоты, фосфатидилглицерина и триацилглицерина были повышены в группе пациенток с наступлением беременности, в то время как уровень глюкозилцерамида был повышен в группе с отсутствием наступления беременности [14]. Данные исследования указывают на связь между липидным профилем ФЖ и исходом беременности и подразумевают, что возможна разработка потенциальных вмешательств по улучшению метаболического поддерживающего состава липидов ФЖ для развивающихся ооцитов и эмбрионов [1, 2, 10, 14, 23].
По результатам оценки липидного профиля плазмы крови 2011 пациенток были определены липидные молекулы, коррелирующие с положительным исходом лечения методами ВРТ. Показатели рождаемости снижались, а частота выкидышей увеличивалась по мере увеличения квартиля холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) (p<0,001). Наличие ЛПНП опосредовало наиболее сильное негативное влияние на исходы лечения, включая более низкую частоту наступления беременности, более низкую частоту живорождения и более высокую частоту выкидышей. Повышенные уровни ТГ и общего холестерина также отрицательно коррелировали с беременностью и рождаемостью. И наоборот, более высокий уровень ЛПВП был связан с большим количеством полученных ооцитов при трансвагинальной пункции, более высокими показателями живорождения и более низкими показателями выкидышей. Данные характеристики ЛПВП опосредованы их противовоспалительной и антиоксидантной ролью. Учитывая, что уровни липидов в сыворотке можно скорректировать физической активностью, диетой или приемом статинов, исследование предполагает не только предикцию исходов лечения путем ВРТ, но и тот факт, что изменение уровней липидов в сыворотке до начала лечения может повлиять на исходы лечения, а именно – помочь в достижении положительного результата [23–25].
Однако необходима дальнейшая работа с целью предикции исходов беременности по липидному составу ФЖ, изменения тактики ведения пациенток и достижения положительного результата в виде живорождения.
Липидом и мужская репродукция
В настоящее время применяется мало методов по отбору наиболее подходящих для оплодотворения сперматозоидов в клинической практике. Рекомендации ВОЗ по анализу спермы имеют значительные ограничения, в первую очередь из-за того, что результаты не позволяют точно предсказать наступление беременности. Появляется все больше доказательств того, что мужская фертильность и нормальная физиология сперматозоидов определяются множеством факторов. С целью более точной оценки мужского репродуктивного потенциала в настоящее время разрабатываются инструменты по идентификации биомаркеров сперматозоидов, которые коррелируют с большей вероятностью репродуктивного успеха. К ним относятся методы определения фрагментации ДНК, профилей экспрессии генов (транскриптомные профили), молекул окислительного стресса, рецепторов гиалуроновой кислоты, убиквитина, фактора активации тромбоцитов и протеомные исследования [26]. В свою очередь липиды как неотъемлемая составная часть мембран сперматозоидов играют критическую роль в регуляции их функции, обеспечивая процесс капацитации, запуская экзоцитоз акросом и, в конечном счете, оплодотворение [27]. Изучение липидного профиля различных образцов спермы (которые используются в циклах с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоидов в ооцит (ИКСИ)) позволит не только улучшить тщательную диагностику мужской фертильности, но и откроет новые возможности по улучшению качества спермы и репродуктивных результатов [26, 28].
Сперматозоиды имеют характерный липидный состав, который влияет на текучесть, гибкость мембран, косвенно оказывая влияние на события, происходящие при оплодотворении. Сперматозоиды имеют более высокую долю нейтральных липидов, особенно большое количество ДАГ. Состав и структура плазматической мембраны сперматозоидов имеют значение в процессе сперматогенеза и созревания сперматозоидов. Во время спермиогенеза в придатках яичка сульфат холестерина может действовать как стабилизатор мембран и ингибитор ферментов. В эякуляте стабильность мембран сперматозоидов зависит от связывания холиновых фосфолипидов с белками семенной плазмы, которые препятствуют перемещению фосфолипидов. Из типов липидов, присутствующих в мужских гаметах, наибольшую долю составляют фосфолипиды. Фосфолипиды характеризуются большой долей алкенилфосфолипидов (плазмалогены) в глицеролфосфатах, содержащих холин и этаноламин, и высоким содержанием высоконенасыщенных жирных кислот, таких как арахидоновая (20:4), докозапентаеновая (22:5) и докозагексаеновая кислоты (ДГК) (22:6). ДГК играет важную роль в целостности мембран, подвижности, жизнеспособности и морфологии сперматозоидов. При добавлении в качестве пищевой добавки эта жирная кислота также увеличивает оплодотворяющую способность; повышается устойчивость спермы к оксидативному стрессу и, следовательно, улучшается качество свежей и размороженной спермы [29–31]. После 32-недельного приема 1,84 г эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) по 0,72 г в сочетании с ДГК по 1,12 г в день у мужчин с олигоастенотератозооспермией и низким уровнем ЭПК и ДГК наблюдалось увеличение количества, подвижности и морфологии сперматозоидов. Следовательно, поверхность сперматозоидов может изменяться или реконструироваться за счет добавления экзогенных липидов или взаимодействия с микроокружением сперматозоидов, способствуя улучшению качества сперматозоидов при подготовке к оплодотворению [16, 32–34].
Фосфолипиды могут быть классифицированы как фосфоглицеролипиды (также известные как глицерофосфолипиды) и сфингомиелин, в зависимости от того, является ли остов глицерином или сфингозином. Во время миграции по женским половым путям сперматозоиды претерпевают ряд биохимических и ультраструктурных изменений, в том числе изменения липидного состава плазматической мембраны. Например, потеря холестерина и фосфолипидов происходит во время капацитации и акросомальной реакции. Свободные жирные кислоты могут повышать подвижность сперматозоидов, их жизнеспособность и способствовать акросомальной реакции [29, 30, 35].
Изменение фракций фосфолипидов и холестерина в сперматозоидах и семенной плазме может влиять на нарушение фертильности мужчин. Так, концентрация триглицеридов увеличивается при олигоастенотератозооспермии, азооспермии и криптозооспермии. При этом отмечено увеличение уровня холестерина в семенной плазме только у пациентов с азооспермией [29, 30]. Уровни общего холестерина в сыворотке крови не коррелируют с параметрами семенной жидкости, что свидетельствует об ином происхождении липидов семенной плазмы [36].
Активные формы кислорода (АФК) также способны изменять полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) в клеточных мембранах, влияя на проницаемость мембраны. Повреждение, вызванное АФК в мембранах половых клеток и клетках сперматогенного эпителия, может привести к их гибели, появлению генетических аномалий, потере подвижности и оплодотворяющей способности зрелых мужских гамет. Предполагают, что некоторые окисленные метаболиты ПНЖК, малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль являются ценными биомаркерами для мониторинга перекисного окисления липидов в сперме [30].
В исследовании, проведенном коллективом авторов из Валенсии под руководством Rivera-Egea R., был изучен липидный анализ сперматозоидов с помощью жидкостной хроматографии сверхвысокого разрешения в сочетании с масс-спектрометрией в бесплодных супружеских парах, получавших лечение методами ВРТ с применением ИКСИ [26]. В образцах спермы была обнаружена 151 молекула липидов. В группе с наступлением беременности преобладали следующие классы: церамиды, сфингомиелины, три вида глицерофосфолипида, два вида плазмалогена. Лизофосфатидилхолин, имеющий только одну ацильную цепь, склонен к образованию изогнутых бислоев и небислойных фаз и коррелировал в группе с отсутствием наступления беременности. Изменение баланса липидов, образующих бислой, с липидами, не индуцирующими бислой, может изменять кривизну мембраны и косвенно влиять на свойства мембранных белков. Авторы описывают состав липидов спермы, связанный с оптимальной функцией сперматозоидов. Учитывая, что липиды составляют большую часть плазматической мембраны сперматозоидов, эта информация также полезна при разработке новых инструментов с целью отбора сперматозоидов для ИКСИ, а именно по профилю липидома, который коррелирует с положительными исходами ВРТ [26, 37].
В независимом исследовании группы ученых из Китая были выявлены 25 уникальных классов липидов и 479 молекулярных видов липидов в группах с астенозооспермией и нормозооспермией. Всего при астенозооспермии были увеличены уровни холестерина, фосфатидилэтаноламина, лизофосфатидилинозитола и моносиалодигексозилганглиозида. Единственным липидом, который положительно коррелировал с прогрессивной подвижностью сперматозоидов, был ТАГ. Была выявлена обратная корреляция уровней общего моносиалодигексозилганглиозида и его шести молекулярных видов с прогрессивной и общей подвижностью сперматозоидов [27]. В основе такого отрицательного влияния заложено связывание ганглиозида GM3 с внеклеточным доменом рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР), что нарушает его димеризацию и аутофосфорилирование, а также ингибирует тирозинкиназную активность рецептора ЭФР. ЭФР является одним из важных цитокинов, играющих роль в сперматогенезе, эпидидимальном созревании сперматозоидов и капацитации. ЭФР может повышать концентрацию сперматозоидов, стимулируя мейотическую фазу сперматогенеза, и стимулировать капацитацию сперматозоидов человека, активируя тирозинкиназу рецептора ЭФР. При астенозооспермии повышенный уровень GM3s может ингибировать активность ЭФР, что приводит к снижению подвижности сперматозоидов [27].
По результатам исследования параметров спермы у 631 мужчины, уровни ТГ, общего холестерина, ЛПНП и ЛПВП в семенной плазме у пациентов с олиго-, астено- и тератозооспермией были выше, чем у пациентов с нормальной концентрацией, подвижностью или морфологией сперматозоидов. Уровни ЛПВП у пациентов с астено- и тератозооспермией были значительно выше, чем у пациентов с нормальной подвижностью или морфологией сперматозоидов. ИМТ обратно пропорционален объему спермы, концентрации сперматозоидов, общему количеству сперматозоидов, подвижности сперматозоидов и проценту нормальной морфологии сперматозоидов. Исследования липидного состава ткани яичка у пациентов с двусторонним варикоцеле как причиной бесплодия показали обильное содержание липидов в ткани семенников, а общее количество липидов составляло 1,90% общего веса ткани. Тестикулярный холестерин составлял 26,50%, глицериды – 28,50% и фосфолипиды – 45% общего количества липидов. В мембранах сперматозоидов наблюдались уровни, выходящие за пределы референсных значений холестерина и фосфолипидов, особенно ПНЖК, тесно связанных с функцией сперматозоидов.
При исследовании зависимости концентраций липидов сыворотки крови и семенной плазмы среди четырех маркеров липидов в сыворотке только уровень ТГ был незначительно связан с уровнем ТГ в семенной плазме. Липидный состав сыворотки крови пациентов практически не коррелировал с параметрами эякулята, в то время как различный уровень липидов в семенной плазме мог в определенной степени влиять на объем эякулята, подвижность сперматозоидов, количество прогрессивно-подвижных, концентрацию и общее количество сперматозоидов. Данные результаты поднимают вопрос о происхождении липидов семенной плазмы и предполагают, что ожирение может влиять на качество спермы в основном за счет аномального метаболизма липидов в мужской репродуктивной системе. Не исключено, что повышенный уровень липидов в семенной плазме, а не в сыворотке крови, является непосредственной причиной снижения качества спермы [38].
Однако остаются вопросы о происхождении липидов семенной плазмы, механизме влияния липидов на качество спермы и факторах, приводящих к нарушению метаболизма липидов [39]. Понимание взаимосвязи состава липидов мембран с процессом созревания мужских гамет поможет лучше понять фундаментальные механизмы сперматогенеза и предложить новые подходы к диагностике и лечению мужского бесплодия, а также разработать новые методики отбора сперматозоидов с целью повышения результативности программ ВРТ [40].
Заключение
Метаболомика является высокоэффективным средством диагностики заболеваний, мониторинга результатов лечения пациентов. В составе метаболитов наиболее быстро и выраженно отображаются все изменения, происходящие в организме, инициируемые как внутренними, так и внешними факторами. Исследования, направленные на обнаружение определенных молекул липидов в репродуктивной медицине, еще раз подтвердили влияние избыточной массы тела на развитие женских и мужских половых гамет. Сравнительный липидомный анализ фолликулярной жидкости, семенной плазмы и сперматозоидов, а также крови пар, страдающих бесплодием, по исходам наступления беременности в программах ВРТ позволит использовать данные метаболиты в качестве неинвазивных маркеров положительного исхода лечения. Исследования, направленные на определение конкретных липидомных метаболитов, представляют особый интерес в программах ВРТ.
