Для нормального протекания беременности, особенно на ее ранних этапах, необходимо обязательное выполнение ряда условий: способность бластоцисты к адгезии и встраиванию в эндометрий матки, способность плаценты к преобразованию сосудистой сети матки для обеспечения необходимого уровня питания будущего эмбриона и плода, формирование плацентой развитой системы микроворсинок для эффективного транспорта необходимого количества питательных веществ, а также нормальная функциональная активность сосудистой системы самой плаценты [1].
Около 25% всех беременностей заканчиваются невынашиванием на ранних этапах именно из-за невыполнения одного или нескольких из этих условий. Другую группу риска составляют беременности, где отклонения возникают уже на поздних этапах и связаны с развитием преэклампсии (5–8% от всех беременностей) и/или синдромом задержки развития плода (СЗРП) (8–14%). Эти два патологических состояния характеризуются плацентарной недостаточностью и драматически повышают риск смертности и заболеваемости, как матери, так и плода в перинатальный период [2, 3].
Несмотря на активное изучение данных патологических состояний, остается еще много белых пятен в патогенезе выше упомянутых заболеваний, однако последние данные указывают на то, что дисфункция плаценты в большинстве случаев коррелируют с отклонениями в функциональной активности стволовых клеток (СК) во время развития плода. Эти данные «подталкивают» к изучению патофизиологии процессов при беременности не просто в контексте формирования плаценты и дисфункции эндометрия матки, а с точки зрения вклада СК в эти процессы.
В самом начале беременности клетки будущего трофобласта формируются из трофэктодермального слоя бластоцисты. На данный момент принято считать, что у человека в этом процессе активно участвуют плюрипотентные клетки внутренней клеточной массы, обеспечивающие трофэктодерму необходимыми сигналами для дифференцировки, которая начинается еще до имплантации [4].
По мере того, как клетки бластоцисты проникают сквозь децидуальный слой эндометрия, трофэктодерма дифференцируется в примитивный слой синцитиотрофобласта, необходимый для успешного разрушения внеклеточного матрикса, что способствует эффективному проникновению бластоцисты в ткани матки, а также нижележащий под ним слой цитотрофобласта – будущую систему микроворсинок плаценты [5]. По мере дальнейшего формирования системы микроворсинок, клетки из слоя внезародышевой мезодермы проникают внутри микроворсинок и формируют первую сосудистую сеть, как правило, на 15-е сутки после оплодотворения [5].
Считается, что формирование и развитие плаценты связано с дифференцировкой двух популяций СК – это СК трофобласта, которые формируют слой трофэктодермы, и фетальные мезенхимные стромальные клетки (МСК), которые формируются из внезародышевой мезодермы [6]. Помимо этого, в процессах имплантации плаценты принимают активное участие и СК эндометрия, в частности – резидентные МСК эндометрия и эпителиальные клетки-предшественники эндометрия [7]. Несмотря на расхождения в полученных экспериментальных данных и не выясненные до конца молекулярные механизмы, посредством которых СК влияют на формирование плаценты и ее встраивание, новая предлагаемая парадигма гласит, что только нормальное функционирование всех этих групп клеток, а также их слаженное взаимодействие могут обеспечить протекание физиологической беременности с позитивным исходом [1]. В клинических случаях с нарушением имплантации плаценты и повторяющимся невынашиванием беременности было показано, что корень проблемы лежит в нарушении физиологического взаимодействия между трофобластом и эндометрием. При этом отмечается, что немаловажную роль здесь играют СК эндометрия, которые ответственны за «подготовку» и «настройку» эндометрия к инвазии плаценты. Именно этот фактор во многом определяет весь ход дальнейшей беременности. Так, было продемонстрировано, что у пациенток, страдающих повторяющимся невынашиванием беременности, нарушен процесс децидуализации стромальных клеток эндометрия [8]. Помимо этого, было показано, что МСК эндометрия секретируют ряд цитокинов, таких как интерлейкин-33 (IL-33) и фактор-ингибитор лейкемии (LIF), участвующих в подготовке эндометрия к имплантации [9].
В дальнейшем было подтверждено, что именно синтез и экспрессия этих цитокинов нарушены у пациенток, страдающих повторяющимся невынашиванием плода.
Вклад плацентарных МСК и СК трофобласта также активно изучается в связи с важностью этих клеток для нормального органогенеза и функционирования плаценты, о чем упоминалось выше. Несмотря на отсутствие работ по сравнению популяций этих клеток в норме и при невынашивании, в ряде случаев этой патологии описано, что процент СК трофобласта в плаценте таких больных намного ниже, чем у здоровых женщин, что, вероятно, и приводит к пониженному числу цитотрофобластов, формирующих будущую систему микроворсинок [10]. Более того, в 60% случаев у пациенток с невынашиванием беременности плаценты были лишены развитой сосудистой сети, что может свидетельствовать о дисфункции МСК плаценты, ответственных за первичное формирование сосудов [11].
В ходе дальнейшего развития плаценты в норме интенсивность ангиогенеза постоянно возрастает, что приводит к расширению сосудистой сети и облегчению транспорта питательных веществ для плода, нужды которого постепенно увеличиваются по мере роста. Помимо расширения сосудистой сети происходит и дальнейшее ветвление системы микроворсинок, что приводит к увеличению площади поверхности для всасывания питательных веществ из организма матери. Оба эти фактора также крайне важны для нормального развития образовавшегося и прикрепившегося эмбриона и возможны только при нормальном функционировании популяций СК плаценты [11, 12].
Преэклампсия и СЗРП – патологии, признаки которых проявляются только после 20-й недели гестации; однако патологический процесс развивается значительно раньше в период первых 12 недель беременности [13]. Это дает возможность предположить, что, несмотря на многофакторную этиологию этих заболеваний, скорее всего, инициация патофизиологических процессов связана с нарушением тех же механизмов, которые лежат в основе раннего эмбрионального развития.
Преэклампсия – комплексное многофакторное заболевание, с неясной этиологией, которое, сопровождается дисфункцией плаценты и/или аномалиями в ее формировании и развитии. На данный момент существует модель, согласно которой нарушения в перестройке спиральных артерий эндометрия матки, маточно-плацентарной гемодинамике, разбалансировке регуляции активности иммунных клеток децидуального слоя, а также в дифференцировке и функционировании трофобласта, своим суммарным действием приводят к секреции плацентой провоспалительных факторов, среди которых цитокины и молекулярные фрагменты, ассоциированные с повреждениями (DAMPs) погибших клеток. Когда уровень этих провоспалительных факторов достигает некоего порогового критического значения для сердечно-сосудистой системы матери, это приводит к системной активации эндотелия сосудов и к запуску провоспалительного системного ответа организмом матери, последствиями которого становятся гипертензия и протеинурия [14].
Исходя из описанных предполагаемых причин преэклампсии, становится очевидным, что как СК плаценты, так и СК эндометрия играют важную роль в развитии патологии. Например, было показано, что МСК, полученные из базальной мембраны плаценты (центральные зоны плацентарных котиледонов) родильниц, страдающих преэклампсией обладают провоспалительным фенотипом. Так, добавление культуральной среды, полученная от таких МСК, к эксплантам микроворсинок из плаценты здоровых родильниц, вызывало резкое увеличение содержания в них провоспалительного фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF), как на уровне мРНК (в 1,75 раза), так и на уровне белка (в 2,4 раза), а также драматическое снижение (в десятки раз) содержания эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF). Исследователи связывают такое падение уровня VEGF с активацией синтеза в тканях микроворсинок после добавления среды от преэклампсических МСК, антиангиогенного фактора, растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt1), которая является растворимым рецептором-ловушкой VEGF [15]. Более того, в рамках данной работы исследователи обнаружили специфичную популяцию МСК, расположенную в мезенхиме микроворсинок, которая, по всей видимости, за счет высокой экспрессии провоспалительного фактора некроза опухоли α (TNF-α) препятствует нормальному функционированию трофобласта. Было показано в условиях in vitro, что этот цитокин снижает подвижность клеток трофобласта [16] и препятствует его встраиванию в организм матери [17]. Необходимо также сказать, что СК трофобласта, вероятно, также принимают активное участие в развитии преэклампсии, в связи с часто встречающейся дисфункцией этой части плаценты при описании развития патологии. Однако, существуют неразрешенные вопросы, касающиеся биологии их «стволовости», способности к мультипотентной дифференцировке, а также фенотипической характеристики in vivo, которые не позволяют пока провести сравнительный анализ этих клеток у здоровых и страдающих преэклампсией рожениц [18]. Тем не менее, существуют работы, где довольно убедительно было продемонстрировано, что МСК базальной мембраны плаценты, полученные от рожениц на ранних этапах преэклампсии, паракринно влияют на зону синцитиотрофобласта, где также располагается отдельная популяция МСК, многократно усиливая в клетках уровень циклина D1, мастер-регулятора G1/S перехода клеточного деления. Такой сигнальный каскад, вероятно, приводит к драматическому увеличению скорости роста клеток в зоне трофобласта и к дальнейшему апоптозу. При этом DAMPs от погибших клеток попадают в материнский кровоток, способствуя системной воспалительной реакции за счет активации эндотелия сосудов, что отмечается на ранних этапах преэклампсии [19].
Как упоминалось выше, в развитии преэклампсии участвуют и МСК эндометрия. Дисфункция эндометрия обычно связана с недостаточным ремоделированием спиральных артерий, что негативно сказывается на снабжении плаценты кровью и питательными веществами [20]. Было показано, что МСК, полученные из децидуального слоя эндометрия рожениц, страдающих преэклампсией, обладают высокой экспрессией провоспалительной межклеточной молекулы адгезии 1-го типа (ICAM-1) и пониженной противовоспалительной молекулы индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) и VEGF-A [21, 22]. Известно, что IDO необходим для обеспечения иммунной толерантности организма матери по отношению к трофобласту зародыша, а VEGF-A обеспечивает выживание клеток трофобласта. Таким образом, можно предположить, что при недостаточном уровне секреции этих факторов МСК эндометрия, возникает предрасположенность клеток трофобласта к апоптозу, что в свою очередь нарушает кровоснабжение плаценты и инициирует развитие патологии [23]. Также недавние исследования продемонстрировали, что у децидуальных МСК повышена экспрессия малой интерферирующей РНК (miR) 136. При этом было обнаружено, что miR 136 не только способствует апоптозу самих МСК, но и в значительной степени препятствует ангиогенезу, блокируя экспрессию и синтез антиапоптотического фактора Bcl-2 (В-клеточная лимфома 2) и ангиогенного VEGF в этих клетках. Более того, супернатант, полученный от МСК с увеличенным уровнем экспрессии miR 136 обладал ингибирующим действием на инвазивную способность клеток трофобласта in vitro [24] .
СЗРП – это полиэтиологическое заболевание, которое может быть обусловлено хромосомными аномалиями и/или пороками развития плода, или возникать вследствие плацентарных нарушений, связанных, прежде всего, с тяжелой преэклампсией. Это заболевание встречается в 5–10% случаев от всех беременностей и драматически (в 10 раз) повышает риск смертности плода, а также заболеваемости новорожденных, по сравнению с нормальной беременностью [25].
СЗРП часто сочетается с преэклампсией, в трети случаев, описанных в клинической практике [26]. Предполагается, что существует несколько этиологических факторов развития СЗРП, связанных с нарушением инвазии трофобласта. Первый связан с недостаточностью ремоделирования спиральных артерий эндометрия или гормон-зависимым расширением нижележащей сосудистой сети матки, вследствие чего, происходит снижение потока питательных веществ в плаценту [14, 20] Второй фактор связан с пониженной экспрессией и функциональной активностью белков-транспортеров синцитиотрофобласта, что драматически снижает способность плаценты потреблять питательные вещества из кровотока матки [27]. Третий фактор связан с морфологическими изменениями в сосудистой сети самой плаценты – заниженным просветом капилляров и уменьшением степени ветвления капиллярных петель [28, 29], что может приводить к снижению их способности поглощать питательные вещества и поставлять их в сосудистую сеть плода.
Поскольку принято считать, что МСК плаценты играют важную роль в васкулогенезе и ангиогенезе во время беременности, можно предположить, что их дисфункция вовлечена в патогенез СЗРП. На сегодняшний день существуют единичные работы по сравнению МСК, полученных из плаценты при СЗРП, с МСК при физиологических родах. Так в 2016 году группа исследователей проводила подобное исследование, где в качестве объектов сравнения использовали МСК плаценты, полученные из зоны плацентарной мембраны и базального диска от здоровых родильниц и женщин, страдающих СЗРП. Было показано, что у МСК в случае СЗРП, несмотря на схожий фенотипический профиль, по сравнению с контролем уже наблюдаются физиологические отклонения в рамках дифференцировки. Так, подобные МСК обладали гораздо большим потенциалом дифференцироваться в адипоциты; помимо этого in vivo было показано, что МСК от пациенток с СЗРП обладают гораздо меньшим ангиогенным потенциалом, связанным со снижением на их поверхности тромбоцитарной/эндотелиальной молекулы адгезии 1-го типа (CD31) и редуцированный способностью образовывать эндотелиальные капилляроподобные структуры. Также in vivo было продемонстрировано, что такие МСК обладают пониженным потенциалом образовывать хорошо разветвленную сосудистую сеть. Все эти наблюдения наводят исследователей на мысль, что в условиях гипоксии, наблюдаемой при развитии СЗРП, в МСК плаценты происходят серьезные эпигенетические перестройки, которые влияют на весь ход развития будущего плода, так как МСК плаценты принимают активное участие в функционировании и в формировании плода [30].
Еще одно исследование также показало, что эндотелиальные клетки предшественники, полученные из пуповинной крови и плаценты женщин, страдающих СЗРП, обладали пониженным потенциалом к васкулогенезу и были представлены в значительно меньшем количестве в тканях плаценты и пуповины, по сравнению с контролем [31, 32]. Предполагается, что нарушение нормальных физиологических условий в гестационном периоде может приводить к «фетальному перепрограммированию» и инициации развития различных тяжелых патологий в более позднем возрасте. Так подобные корреляции были уже показаны для диабета 2-го типа, гипертензии и коронарной болезни сердца [33].
Таким образом, необходимо подытожить, что, несмотря на значительную частоту СЗРП при беременности, часто единственным эффективным способом не допустить внутриутробной гибели плода, по-прежнему остается инициация досрочного родоразрешения. Также существует нерешенная проблема диагностики преэклампсии и СЗРП на ранних этапах беременности. Изучение биологии СК плаценты и эндометрия, а также молекулярных патофизиологических механизмов, инициируемых ими, поможет в дальнейшем более эффективно бороться с этими тяжелыми диагнозами, ставящими под угрозу жизнь матери и плода.
Принимая во внимание, что в патогенез больших акушерских синдромов вовлечена дисфункция СК, можно предположить, что использование клеточной терапии будет являться базой для патогенетической терапии данных патологий.
На протяжении последних нескольких десятилетий был достигнут значительный прогресс в понимании биологии СК, что позволяет говорить об их широком применении в клинической практике в будущем. Во-первых, это связано со способностью клеток восстанавливать поврежденные участки ткани, осуществлять иммуномодуляцию воспалительных процессов при различных заболеваниях. Также показано, что в случае тяжелых патологий собственные аутологичные клетки пациентов не всегда оказываются эффективными. В связи с этим был проведен ряд исследований по применению аллогенных СК от здоровых доноров, которые показали безопасность их введения, связанную с низкой иммуногенностью для организма реципиента, а также большую терапевтическую эффективность. На данный момент показано успешное применение СК для восстановления функций сердца, головного мозга, почек, печени, кожи и ряда других тканей и органов [6]. Еще одним фактором в пользу применения CК является разнообразие источников для их получения. Несмотря на растущее с каждым годом, по данным clinicaltrials.gov, количество исследований по применению СК для лечения различных патологий, довольно мало внимания уделялось патологиям, связанным с плацентарной недостаточностью. Лишь только несколько лет назад была предпринята попытка применения СК (в частности МСК) для лечения синдрома Ашермана и проблемы невынашивания беременности [34]. При этом было убедительно доказано, что в данной ситуации терапевтический эффект был обусловлен именно трансплантацией клеток, а не базовой терапией [35].
Преэклампсия и СЗРП сопровождаются нарушением кровообращения между матерью и плодом, воспалительными процессами и дисфункцией, как плаценты, так и эндометрия. В первой части обзора была изложена концепция влияния резидентных СК плаценты и эндометрия на вклад в развитие патологий при беременности. Таким образом, основываясь на современном понимании терапевтических механизмов клеточной терапии, можно предположить, что те же самые СК, в частности МСК, полученные от здоровых доноров, могут вполне эффективно оказывать терапевтическое действие на данные заболевания путем взаимодействия с микроокружением и реализации своих биологических механизмов, направленных на восстановление гомеостаза. Наиболее часто в качестве источников для выделения и культивирования МСК используют жировую ткань и костный мозг. Клетки из этих тканей обладают высокими регенеративными и иммуномодулирующими свойствами, хорошо охарактеризованы; их получение связано с минимальными хирургическими вмешательствами для организма, протоколы их выделения отработаны, а методика культивирования на настоящий момент превратилась в рутинную процедуру. Однако, данные последних лет указывают на то, что МСК из различных источников все же обладают особенностями и функциональной специфичностью. Например, МСК, выделенные из плаценты, гораздо менее эффективно дифференцируются в клетки кости и хряща, чем МСК костного мозга [36], но при этом они незаменимы на стадиях развития трофобласта и дальнейшей васкуляризации плаценты. Однако на сегодняшний день не имеется клинических исследований по применению МСК из различных источников для терапии патологий беременности, чтобы дать ответ на этот вопрос.
В случае развития преэклампсии, СЗРП, а также инфаркта плаценты, МСК, по всей вероятности, будут оказывать свой терапевтический эффект, способствуя восстановлению кровотока, увеличению плотности сосудов и препятствуя развитию некроза ткани, что неоднократно было продемонстрировано на различных моделях инфарктов миокарда у животных [37, 38]. Несмотря на неполную ясность в биологическом механизме действия МСК, предполагается, что большая доля этих эффектов будет достигнута за счет паракринного действия МСК: cекреции ангиогенного фактора VEGF, фактора роста тромбоцитов β (TGF-β), антиапоптотического инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), секретируемого белка связанного с ожогом 2 (Sfrp2) [39, 40], а также за счет стимуляции аутологичных клеточных предшественников, так как процент встраивания самих МСК в поврежденный участок, по данным многочисленных исследований, крайне низкий и не превышает в лучшем случае 3–4% [41].
Вторым неотъемлемым последствием выше описанных патологических состояний является воспалительный процесс, который осуществляется пришедшими в очаг поражения лимфоцитами, а также макрофагами и другими клетками иммунитета. Активация всех участников воспалительного ответа приводит к развитию хронического процесса, что часто наблюдается при преэклампсии в результате активации клеток эндотелия сосудов матери, под действием провоспалительных цитокинов, секретируемых плацентой, [14] и при воспалительных процессах в ворсинках хориона [42]. В этом случае МСК также могут оказывать терапевтическое действие. Так, многочисленными исследованиями была показана модулирующая функция МСК на клетки иммунитета в зависимости от их иммунного статуса (степени активности) [43]. Важно отметить, что МСК не «выключают полностью из работы» иммунные клетки, а временно снижают их способность к активации и созданию провоспалительного микроокружения, что крайне важно для нормального функционирования организма. Было продемонстрировано влияние МСК на Т- и В-лимфоциты, путем снижения их пролиферации и секреции провоспалительных цитокинов – интерферона-γ (IFN-γ) и TNF-α. В то же самое время считается, что МСК способствуют индукции регуляторной популяции Т-клеток, секретирующих антивоспалительный IL-10 [44]. Помимо этого показано влияние МСК на пролиферацию и функциональную активность натуральных киллеров и макрофагов, которые также играют важную роль в поддержании иммунного гомеостаза плаценты и матки в целом [45, 46].
Cвое уникальное иммуномодулирующее действие МСК осуществляют путем реализации молекулярной программы, оценивающей микроокружение и в зависимости от этого запускающей синтез провоспалительных или антивоспалительных факторов. Среди антивоспалительных факторов наиболее хорошо изучены IDO, оксид азота (NO), простагландин Е2 (PGE2), TGF-β, активность которых неблагоприятно воздействует на иммунные клетки, снижая их способность участвовать в воспалительном ответе [47].
Таким образом, существуют все предпосылки для инициации исследований, с одной стороны роли СК в патогенезе синдромов, связанных с фетоплацентарной недостаточностью, а с другой стороны, их терапевтических эффектов после трансплантации. Недавно были получены обнадеживающие результаты на мышиной модели преэклампсии, инициируемой провоспалительными факторами. Через 2 недели после появления симптоматики мышам трансплантировали человеческие МСК, выделенные из плаценты, жира, или костного мозга здоровых доноров. Полученные результаты отчетливо продемонстрировали, что в рамках данной экспериментальной системы, МСК жировой ткани и костного мозга оказались абсолютно не эффективными для купирования преэклампсии, в то время как МСК плаценты оказывали мощное терапевтическое и регенеративное действие на животных, по сравнению с контрольной группой. Наблюдалась нормализация систолического кровяного давления, а также уровня белка в моче и провоспалительного цитокина IL-6 в плазме. Более того, было отмечено, что введение МСК плаценты препятствовало образованию некротизированных участков в тканях плаценты, а также драматически снижало зоны повреждения сосудов у децидуального слоя эндотелия матки и спонгиотрофобласта плаценты, что указывает на высокую эффективность регенераторного потенциала МСК плаценты в данных условиях. Исследователи полагают, что описанные эффекты вызваны паракринным действием факторов, которые секретировали МСК, таких как матриксная металлопротеиназа человека 1-го типа (hMMP-1) и ее тканевой ингибитор (hTIMP), эпидермальный фактор роста (mEGF), которые могут быть ответственны за предотвращение некротической гибели клеток и восстановление сосудов. Также в плазме животных были обнаружены человеческие IL-15 и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (hGM-CSF), которые необходимы для подготовки поврежденного участка к репарационному процессу. Данное исследование не только вселяет надежду на успех в лечении преэклампсии с помощью клеточной терапии, но и четко указывает на специфичность действия МСК плаценты по отношению к данной патологии, что в очередной раз поднимает вопрос об особенностях резидентных МСК из различных источников [48].
Накопленный экспериментальный и клинический опыт все больше убеждает в целесообразности их использования для терапии тяжелых патологий и метаболических расстройств. Причем, в рамках патологий беременности становится все более ясным, что имеет смысл использовать именно МСК плаценты или пуповины, так как, по последним данным [48], они оказывают наиболее выраженный терапевтический эффект. Видимо, это связано с их запрограммированными функциональными особенностями, эволюционно заложенными под действием тканевого микроокружения, плаценты, которое отличается от такого в костном мозге или жировой ткани. Кроме того, это удобный источник получения МСК для центров, специализирующихся на проблемах женского здоровья и деторождения, в связи с возможностью быстрого получения, характеризации и культивирования необходимого количества клеток для терапевтических целей. Но остается нерешенным один важный вопрос: какие МСК все же лучше использовать? С позиции сегодняшнего дня на этот вопрос можно ответить следующим образом. Если брать в расчет резидентные аутологичные МСК пуповины или плаценты, по всей видимости, они не будут оказывать никакого позитивного эффекта, так как в них уже могли произойти определенные эпигенетические функциональные нарушения, которые вряд ли возможно исправить в условиях in vitro с помощью инструментария молекулярно-генетических методов. Намного эффективнее использовать охарактеризованные резидентные МСК здоровых доноров, которые, за счет своей тканевой специфичности, будут оказывать максимальный эффект, изначально обладая свойствами, способствующими поддержанию нормального гомеостаза конкретной ткани, в данном случае плаценты и ее окружения.
Заключение
Таким образом, не остается сомнений, что в ближайшем будущем клеточная терапии займет достойное место среди других терапевтических методов для лечения патологий беременности. Чтобы ускорить этот процесс необходимо проводить дальнейшие исследования с целью установления всех деталей молекулярных механизмов функционирования МСК в норме и при нарушениях: преэклампсии, СЗРП и других патологиях. Именно различия и особенности в «молекулярном поведении» МСК в обеих ситуациях помогут сделать их клиническое применение более эффективным.
