Проблема бесплодия является одной из центральных проблем в акушерстве и гинекологии. Причиной бесплодия могут быть нарушения репродуктивной системы у одного или обоих супругов. Выявление конкретных причин бесплодия и последующая их коррекция часто способствуют естественному наступлению беременности, однако в ряде случаев требуется применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Несмотря на развитие и совершенствование технологий оказания помощи при бесплодии, потери беременности на различных ее сроках сохраняются достаточно высокими и составляют, по разным данным, от 20 до 30% [1].
В основе многих случаев бесплодия лежит нарушение рецепторных взаимодействий между бластоцистой и эндометрием. В научной литературе часто используется понятие «рецептивность эндометрия», обозначающее сложный комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с определёнными временными и пространственными параметрами [2]. Эмбрион имеет возможность имплантироваться в подготовленный к этому эндометрий, причем это возможно только в определенный период менструального цикла, называемый «окном имплантации» (6–8-й день после пика ЛГ и овуляции). Этому периоду соответствует конец ранней секреторной фазы и начало средней секреторной фазы. Морфологические изменения эндометрия являются определяющими для формирования «окна имплантации», однако также важную роль играет экспрессия молекулярных и иммуногистохимических маркеров в эндометрии в этот же период [3].
Неоднократные неудачные попытки программы ЭКО при проведенном полном объеме обследований у пациенток с бесплодием и при переносе им эмбрионов высокого качества указывают на то, что одной из причин бесплодия у женщин данной группы могут быть нарушения процессов имплантации эмбриона, связанные с нарушением рецептивности эндометрия [4].
В связи с этим представляет интерес и является актуальным изучение молекулярно-генетических особенностей эндометрия в имплантационный период, так как от состояния эндометрия в значительной степени зависят важные процессы в реализации репродуктивного потенциала у женщин. Среди множества генов, активируемых в период «окна имплантации», последнее время особое внимание уделяется семейству НОХ-генов.
НОХ-гены и репродуктивная система женщины
Процессы роста и дифференцировки клеток и тканей в организме контролируются множеством генов, среди которых особо выделяются гомеозисные гены (греч. homios – подобный). Эти гены кодируют транскрипционные факторы, содержащие общий ДНК-связывающий домен длиной около 180 п.о. – гомеобокс (homeobox). Гомеозисные гены регулируют работу многих других генов и определяют образование и индивидуальные свойства различных сегментов эмбриона [5].
У млекопитающих эти гены образуют, среди прочих, кластеры HOX-генов. HOX-гены являются абсолютно необходимыми для развития многоклеточных организмов. Всего у человека имеется 39 НОХ-генов, которые подразделяются на 4 кластера: A, B, C и D. Большинство мутаций приводят к формированию нежизнеспособного эмбриона. С другой стороны, высокая степень гомологии между НОХ-генами разных кластеров приводит к функциональной избыточности, за счет чего один НОХ-ген может компенсировать утрату функции вследствие мутации другого НОХ-гена [6].
Часть членов семейства НОХ-генов экспрессируется в эмбриональном периоде человека в определенных зонах вдоль вольфовых и мюллеровых протоков. Ген НОХА9 экспрессируется на участке мюллерова протока, дающем начало маточной трубе, НОХА10 – в развивающейся матке, НОХА11 – в области будущих тела и шейки матки, а НОХА13 – на месте будущей шейки матки и верхней трети влагалища [7].
После эмбрионального периода экспрессия НОХ-генов значительно снижается в организме человека, но эндометрий является одной из немногих тканей, где экспрессия данных генов продолжается и во взрослом организме [8].
НОХ-гены в регуляции рецептивности эндометрия
Циклические изменения эндометрия у женщин репродуктивного возраста происходят по аналогии с развитием тканей и органов у эмбриона. Известно, что многие гены, всегда считавшиеся регуляторами эмбрионального развития, участвуют в контроле циклической трансформации эндометрия в течение менструального цикла. Большое внимание в настоящее время уделяется роли семейства НОХ-генов. В последние годы была показана важная роль продуктов экспрессии генов НОХА10 и НОХА11 в реализации репродуктивного потенциала у женщин [9].
Данные гены экспрессируются в ядрах эпителия желез и строме эндометрия в различных участках матки; в период «окна имплантации» их экспрессия значительно возрастает и остается повышенной до конца менструального цикла [10]. Данный процесс является гормонозависимым и активируется под действием эстрогенов и прогестерона в секреторной фазе менструального цикла [11]. При этом пик экспрессии НОХА10 приходится именно на период «окна имплантации», что позволяет предположить важную роль продукта экспрессии данного гена в процессе имплантации эмбриона [12]. Описано около 40 генов, регулируемых НОХА10, среди которых гены, участвующие в регуляции рецептивности эндометрия [3]. Известно, что большое значение в развитии пиноподий – апикальных выпячиваний плазматической мембраны поверхностного слоя эндометрия – имеет ген НОХА10, блокирование которого приводит к резкому уменьшению количества пиноподий [13]. Было показано, что в процессе децидуализации клеток эндометрия в них значимо повышается экспрессия HOXA10 и HOXA11 и гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF [14]. Таким образом, к числу ключевых регуляторов процессов рецептивности эндометрия, предопределяющих фертильность, принадлежат гены НОХА10 и НОХА11 и кодируемые ими белки.
Известно, что при различных патологических состояниях к снижению уровня белка в ткани могут приводить как генетические причины (мутации кодирующего его гена), так и различные эпигенетические отклонения, в том числе и метилирование промоторной области гена. Метилирование ДНК – это модификация молекулы ДНК без изменения самой последовательности нуклеотидов. Метилирование ДНК заключается в присоединении метильной группы к цитозину в составе CpG-динуклеотида в позиции С5 цитозинового кольца. Именно метилирование промоторного участка гена приводит к снижению экспрессии гена, вплоть до полной его инактивации («эпигенетическое выключение») [15]. По данным литературы в эндометрии здоровых женщин репродуктивного возраста не наблюдается промоторного метилирования генов НОХА10 и НОХА11 [16, 17].
В последние годы гинекологические заболевания, в том числе и ассоциированные с бесплодием, все чаще начинают рассматриваться как результат нарушения работы генов. Изменение экспрессии НОХА10 и НОХА11 генов было выявлено при эндометриозе, хроническом эндометрите, миоме матки и других патологиях женских половых органов [18].
НОХ-гены и эндометриоз
Эндометриоз – хроническое гормонально-зависимое заболевание с рецидивирующим течением, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, которая по морфологическим и функциональным свойствам подобна эндометрию. Было показано, что эндометриозом страдает около 10% женщин репродуктивного возраста, причем у 20–50% женщин с эндометриозом диагностируется бесплодие [19]. В мета-анализе наблюдательных исследований, включившем 8984 женщины, было показано, что эндометриоз снижает вероятность успешных исходов в программах ВРТ. При эндометриозе I/II стадии была понижена частота успешного оплодотворения, относительный риск (ОР) составил 0,93, 95% доверительный интервал (ДИ) 0,87–0,99. При эндометриозе III/IV стадии снижалась частота успешной имплантации (ОР 0,79, 95% ДИ 0,67–0,93) и частота клинической беременности (ОР 0,79, 95% ДИ 0,69–0,91) [20].
К вероятным причинам бесплодия при данном заболевании относят нарушение фолликулогенеза, плохое качество ооцитов и нарушения процесса имплантации эмбриона. В последние годы было выявлено, что вклад в развитие бесплодия у пациенток с эндометриозом вносит изменение профиля метилирования ДНК в клетках эндометрия [21], в том числе генов НОХА10 и НОХА11, участвующих в эмбриогенезе и формировании рецептивности эндометрия [22].
HOXA10 влияет на экспрессию гена ЕМХ2, экспрессия которого в норме снижается в периимплантационный период, однако при нарушении данной регуляторной связи наблюдается нарушение процессов имплантации [9]. Также ген НОХА10 контролирует работу гена интегрина β3. Интегрин β3 экспрессируется в эндометрии в период «окна имплантации», и снижение его экспрессии связано с нарушением рецептивности эндометрия и бесплодием. У женщин с эндометриозом описано нарушение экспрессии как гена НОХА10, так и гена интегрина β3 [23]. Было показано, что эпигенетическая регуляция работы генов может быть связана с патогенезом эндометриоза. В моделях эндометриоза у мышей и бабуинов было показано гиперметилирование промотора НОХА10 гена и его сниженная экспрессия в эутопическом эндометрии [24, 25].
В эндометрии 14 женщин с бесплодием и минимальным эндометриозом, 16 женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и 16 здоровых женщин в середину лютеиновой фазы с помощью вестерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) определялась экспрессия HOXA11. Уровень мРНК и белка HOXA11 при эндометриозе был значительно ниже, чем у здоровых женщин (p=0,003 и p=0,004 соответственно) и женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия (p=0,041 и p=0,001 соответственно). Кроме того, при эндометриозе, по сравнению с другими группами, было значимо повышено метилирование CpG-островка в 1-м экзоне гена HOXA11 (p<0,001) [16].
Ранее той же группой авторов при изучении образцов эутопического эндометрия у 17 женщин с бесплодием и эндометриозом и 15 здоровых пациенток было показано, что при эндометриозе значимо понижены уровни транскрипта (p=0,019) и белка (p=0,048) гена HOXA10. При этом было подтверждено значимо повышенное метилирование CpG-островков геномной ДНК при эндометриозе (p=0,006) [17]. Другой группой также было показано понижение экспрессии мРНК гена HOXA10 в эутопическом эндометрии в середину лютеиновой фазы при бесплодии, связанном с эндометриозом, что ассоциировалось с повышенным метилированием промотора HOXA10 [26].
В исследовании с участием 31 женщины с бесплодием и эндометриозом и 26 женщин с бесплодием без эндометриоза в эндометрии в окно имплантации при эндометриозе обнаружилось не только понижение экспрессии HOXA10 и HOXA11, но и более высокая экспрессия генов матриксных металлопротеиназ MMP2 и MMP9 [27].
С помощью иммуногистохимии (ИГХ) и ПЦР-РВ была изучена экспрессия HOXA10 в эндометрии в середину секреторной фазы у женщин с эндометриозом, а также миомами, бесплодием неясного генеза и у здоровых женщин. В стромальных клетках эндометрия всех групп больных были понижены как мРНК, так и белок HOXA10. Уровень мРНК HOXA10 был значительно ниже в железистом эпителии, чем в стромальных клетках. Процент пациентов со снижением уровня белка HOXA10 был статистически значимо выше при поверхностном эндометриозе брюшины (100%, 20/20, p<0,05), чем в других группах бесплодия: 72,7% (16/22) при глубоком инфильтрирующем эндометриозе, 70,0% (14/20) при эндометриоидных кистах яичников, 68,8% (11/16) при миомах и 55,6% (5/9) при бесплодии неясного генеза [28].
В пилотном исследовании с участием 18 пациенток с эндометриозом и 12 женщин без эндометриоза была изучена разница в метилировании двух последовательностей промотора HOXA10 в эутопическом и эктопическом эндометрии. Было обнаружено значительное повышение метилирования в эутопическом эндометрии при эндометриозе, чем в случае без эндометриоза: 8,68 против 6,25% (p=0,037) и 11,89 против 9,25% (p=0,032) для последовательностей 1 и 2 соответственно. Также уровень метилирования был значительно выше в эутопической ткани при эндометриозе, чем в эктопической: средняя разница для последовательности 1 и 2 составила −3,6 (p=0,001) и −6,0 (p=0,0001) соответственно [29].
В исследовании случай-контроль у 20 бесплодных пациенток с одно- или двусторонней эндометриоидной кистой яичника, 5 пациенток с не эндометриоидными доброкачественными кистами яичников и 5 здоровых женщин в середину лютеиновой фазы был получен образец эндометрия. У пациенток после резекции кисты спустя 3 месяца в середину лютеиновой фазы была проведена повторная биопсия эндометрия. Во всех образцах определялась экспрессия мРНК генов HOXA10 и HOXA11. Отмечалась тенденция к сниженной экспрессии HOXA10 и HOXA11 при эндометриоидных и неэндометриоидных кистах в сравнении со здоровыми женщинами, однако различия не были значимыми. После удаления эндометриоидных кист отмечено значимое повышение экспрессии HOXA10 и HOXA11 в 12,1 и 17,2 раза соответственно, что может указывать на улучшение рецептивности после операции [30].
Изучение метилирования промотора гена HOXA10 в крови плода при эндометриозе у матери позволило показать, что у плодов 22 женщин, принимавших фолиевую кислоту, уровень метилирования HOXA10 был значительно ниже, чем у плодов 15 матерей, не принимавших фолиевую кислоту [31].
Обработка стромальных клеток эндометрия, полученных из эутопического эндометрия женщин с эндометриозом, с помощью деметилирующего агента 5-азацитидина приводила к значительному повышению уровня мРНК и белка HOXA10 [32].
НОХ-гены и миома матки
Миома матки – это доброкачественная гормонально-зависимая опухоль миометрия, возникающая у женщин репродуктивного возраста. По данным многих авторов, наличие миомы может снижать вероятность наступления беременности, в том числе в программах ВРТ, однако конкретные механизмы остаются не до конца понятными [33]. Предполагается возможная роль генов HOXA10 и HOXA11 в данной патологии [34].
С помощью ИГХ и ПЦР-РВ была изучена экспрессия генов HOXA10 и HOXA11 во время окна имплантации у пациенток с бесплодием и недеформирующими интрамуральными миомами (n=18) в сравнении со здоровыми женщинами (n=12). Уровень мРНК и белков HOXA10 и HOXA11 был ниже у женщин с бесплодием, однако статистически значимое снижение было отмечено только для уровня мРНК HOXA10 (p=0,03) и для стромального уровня белка HOXA10 (p=0,001), что позволило авторам предположить роль HOXA10 в нарушении рецептивности эндометрия у женщин с бесплодием при интрамуральных миомах [35].
В другом исследовании изучалась паракринная роль трансформирующего фактора роста (TGF)-β3, секретируемого миомами матки, в ингибировании рецептивности и децидуализации эндометрия. Миоматозные и эндометриальные стромальные клетки изолировались из хирургических образцов. Среда после культивирования клеток миомы наносилась на клетки эндометрия, что приводило к TGF-β зависимому угнетению экспрессии мРНК HOXA10. Предварительная обработка антителами к рецепторам TGF-β или трансфекция клеток мутантными рецепторами приводила к предотвращению угнетения экспрессии HOXA10, что указывает на возможный механизм нарушения рецептивности эндометрия при миомах [36].
В исследовании роли миом в нарушении рецептивности in vivo принимали участие женщины с интрамуральными миомами, не деформирующими полость матки, подслизистыми миомами, перегородкой матки и здоровые женщины. У каждой участницы образец эндометрия был получен в окно имплантации, а у пациенток, прошедших миомэктомию, также и после операции. До операции уровень экспрессии HOXA10 и HOXA11 при миомах был ниже, чем у двух остальных групп, но статистически незначимо. Однако после миомэктомии интрамуральных миом произошло значимое повышение экспрессии HOXA10 в 12,8 раза и HOXA11 в 9,0 раза. В то же время удаление подслизистых миом не оказало значимого влияния на экспрессию данных генов [37]. В другом исследовании при сравнении экспрессии генов HOXA10 и HOXA11 в середину лютеиновой фазы 12 женщин с бесплодием и интрамуральными миомами до и через три месяца после миомэктомии не удалось показать значимого изменения уровня мРНК данных генов, что может указывать на более комплексную регуляцию экспрессии в живом организме [38].
НОХ-гены и трубно-перитонеальный фактор бесплодия
В проспективном обсервационном исследовании была проведена биопсия эндометрия на 7–8-й день после овуляции у 25 здоровых женщин и 65 пациенток с бесплодием, из которых у 22 был отмечен плохой овариальный резерв, у 13 – трубное бесплодие, у 5 – эндометриоз и у 15 – бесплодие неясного генеза. Была проведена ИГХ-оценка уровня белков HOXA10 и HOXA11 в эпителиальных и стромальных клетках путем стандартного расчета гистохимического индекса (h-score). При сравнении двух групп (здоровые и бесплодные женщины) различия в уровне белков HOXA10 и HOXA11 в стромальных и эпителиальных клетках не были значимыми, однако при анализе подгрупп бесплодия было выявлено, что уровень HOXA11 был минимальным в эпителии при бесплодии неясного генеза, статистически достоверно отличаясь от уровня в контрольной группе (p=0,005) [39].
Гидросальпинкс (ГС) – заболевание маточной трубы, характеризующееся нарушением ее проходимости со скоплением в просвете трубы жидкости. Было показано, что у женщин с ГС частота наступления беременности в программах ВРТ ниже, чем у женщин без данной патологии, причем предварительная тубэктомия или перевязка маточных труб положительно влияла на исходы программы [40]. Доказано, что жидкость, накапливающаяся в полости измененной маточной трубы, эмбриотоксична, поскольку в ней содержатся лимфоциты, микроорганизмы, погибшие клетки слизистой маточной трубы. Погружение эмбрионов морских свинок и мышей в жидкость из ГС приводило к нарушению или полному прекращению дробления клеток эмбрионов, а в другом исследовании in vitro было показано, что жидкость из ГС подавляла экспрессию мРНК гена НОХА10 дозозависимым образом [9]. Также было показано, что у женщин с ГС уровень экспрессии НОХА10 был значительно ниже, чем у женщин в группе контроля, а удаление патологической измененной маточной трубы привело к повышению экспрессии HOXA10 на уровне белка и мРНК [41].
НОХ-гены и другие патологические состояния, связанные с бесплодием
Помимо перечисленных выше заболеваний среди наиболее частых патологических состояний эндометрия, наблюдающихся при бесплодии, неудачах имплантации и привычных выкидышах, отмечают также полипы эндометрия, нарушения кровотока в сосудах эндометрия и хронический эндометрит [42]. В исследовании случай-контроль с участием 21 женщины с эндометриальными полипами и 9 здоровых женщин без полипов было показано, что экспрессия мРНК гена HOXA10 значимо снижена в 2,9 раза (p=0,016), а HOXA11 – в 5,5 раза (p=0,03) при наличии полипов относительно контрольной группы. При этом разница в размере полипов и их количестве значимо не влияла на изменение экспрессии данных генов [43].
В наблюдательном когортном исследовании приняли участие 18 здоровых женщин, 12 женщин с привычными неудачами имплантации и 20 женщин с привычным невынашиванием. Изучение экспрессии белка HOXA10 с помощью ИГХ в «окно имплантации» данных групп показало, что белок преимущественно локализуется в ядрах стромальных клеток и цитоплазме железистого эпителия. Гистохимический индекс для HOXA10 в строме и эпителии при неудачной имплантации и невынашивании был значимо ниже, чем в контрольной группе, что может указывать на роль данного гена в неудачных исходах программ ВРТ [44].
Было проведено исследование целого ряда гинекологических заболеваний, играющих роль в бесплодии, включая 13 случаев подслизистых миом, 13 случаев интрамуральных миом, 27 случаев эндометриоза, 6 случаев внутриматочной перегородки, 8 случаев синдрома Ашермана, 4 случая ГС и 11 случаев полипов эндометрия, а также 7 контрольных случаев здоровых женщин-доноров яйцеклеток. В целом в образцах эндометрия во всех группах был показан низкий уровень метилирования ДНК. Отмечалось очень небольшое количество CpG-островков, метилированных более чем на 50%, однако ряд регионов был метилирован специфично. Например, отмечалось высокое метилирование в ряде CpG-островков промотора гена HOXA10 при полипах эндометрия, подслизистых и интрамуральных миомах. Интересно, что в противоположность многим другим исследованиям группой J.L. Kulp было отмечено, что метилирование промотора HOXA10 при эндометриозе оказалось снижено относительно здорового контроля [45].
Хронический эндометрит – это клинико-морфологический синдром, характеризующийся комплексом морфофункциональных изменений эндометрия воспалительного генеза, приводящих к нарушению нормальной циклической трансформации и рецептивности ткани. У женщин с подтвержденным хроническим эндометритом бесплодие диагностируется в 60% случаев, а неудачные попытки ЭКО – в 40–50% случаев [46]. У 25 женщин репродуктивного возраста, страдающих бесплодием на фоне хронического эндометрита, были получены биоптаты эутопического эндометрия. Показано, что у 21 пациентки (84%) наблюдалось метилирование в промоторном участке гена НОХА10, а у 16 пациенток – гена НОХА11 (64%). Уровень метилирования коррелировал с длительностью бесплодия: при бесплодии длительностью до 1 года уровень метилирования составил 5,7%, тогда как при бесплодии более 10 лет – приближался к 50% [15].
Было показано, что снижения уровня метилирования генов при различных заболеваниях можно добиться использованием таких препаратов, как индол-3-карбинол и эпигаллокатехин-3-галлат. Так, в российском исследовании с участием 32 женщин с хроническим эндометритом, 31 женщины с эндометриальными полипами, 43 женщин с простой формой гиперплазии эндометрия без атипии, 46 женщин с комплексной гиперплазией без атипии и 42 женщин с комплексной гиперплазией и атипией было показано, что прием данных препаратов в комплексе со стандартным лечением приводил к снижению метилирования генов-опухолевых супрессоров и к излечению указанных патологий без рецидива в течение года, в то время как рецидив при использовании только стандартной терапии отмечался в разных группах в 2,2–16,0% случаев [47].
В исследовании у 25 женщин с бесплодием на фоне хронического эндометрита было показано наличие гиперметилирования промоторов генов HOXA10 и HOXA11 в ткани эндометрия. Применение индол-3-карбинола и эпигаллокатехин-3-галлата привело к снижению метилирования у всех участниц исследования, при этом 4 из 25 женщин смогли забеременеть естественным путем [47]. Предполагается, что эпигаллокатехин-3-галлат ингибирует фермент ДНК-метилтрансферазу, который поддерживает метилирование ДНК.
Таким образом, в связи с тем, что одной из причин снижения экспрессии генов НОХА10 и НОХА11 при различных вышеперечисленных патологических состояниях является метилирование промоторных участков данных генов, применение препаратов, вызывающих деметилирование, вероятно, может считаться одним из способов терапевтического лечения данных заболеваний.
Заключение
НОХ-гены и продукты их экспрессии играют важную роль в становлении репродуктивной системы и в реализации репродуктивного потенциала женщины. Гены НОХА10 и НОХА11 являются одними из ключевых регуляторов процессов рецептивности эндометрия. Нарушение экспрессии данных генов ведет к нарушению процесса имплантации и, как следствие, снижает частоту наступления беременности. Ряд гинекологических заболеваний, таких как эндометриоз, миома матки, хронический эндометрит, связаны с бесплодием. При этих заболеваниях было обнаружено нарушение экспрессии генов НОХА10 и НОХА11. Указанные факты делают актуальным изучение причин нарушения работы данных генов и поиск возможных способов воздействия на их экспрессию с целью лечения бесплодия и различных гинекологических заболеваний, которые часто тесно связаны с данной проблемой.
