Без сомнений, вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) являются наиболее эффективным методом достижения беременности у супружеских пар, страдающих бесплодием. Однако, несмотря на колоссальные успехи в области репродукции и непрерывное совершенствование методов ВРТ, частота наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) не превышает 30–40% в расчете на перенос эмбрионов и не имеет тенденции к увеличению [1]. При этом около 20% беременностей, наступивших в программах ВРТ, заканчиваются ранними репродуктивными потерями [1]. На результативность программ ЭКО влияет множество факторов, но основополагающим является установление «диалога» между кариотипически нормальным эмбрионом хорошего качества и рецептивным эндометрием [2]. Значительный вклад в этиологию ранней эмбриональной гибели и неудач имплантации вносят анеуплоидии. Известно, что около 55% ранних репродуктивных потерь ассоциировано с эмбриональными анеуплоидиями [3]. При этом доказано существование прямой корреляции между частотой образования анеуплоидных эмбрионов и возрастом женщины. Так, если у женщин в возрасте 26–30 лет доля анеуплоидных эмбрионов составляет 20–27%, то в возрасте 45 лет 95,5% эмбрионов имеют хромосомные аномалии [4].
В структуре эмбриональных анеуплоидий основное место занимают трисомии, частота которых может достигать 68% [5]. Хромосомные аномалии могут развиваться вследствие мейотических ошибок, возникающих на этапе гаметогенеза и митотических или постзиготических ошибок, развивающихся после оплодотворения. Известно, что мейотические ошибки в большинстве случаев вызваны несбалансированным делением хроматид и нерасхождением хромосом в ооците. Природа оогенеза такова, что женские гаметы в большей степени подвержены хромосомным аномалиям на стадии мейоза, чем мужские, особенно по мере увеличения возраста женщины [6]. Анеуплоидии постзиготического происхождения возникают во время деления клеток эмбриона, и чем раньше они появляются, тем более обширными и неблагоприятными для жизнеспособности эмбриона могут стать. Ошибки митоза в большинстве случаев ассоциированы с неправильной сегрегацией хромосом и часто приводят к развитию мозаицизма [7].
Использование визуальных методов оценки качества эмбрионов не позволяет исключить перенос анеуплоидного эмбриона в полость матки [8]. В 44,5% случаев анеуплоидные эмбрионы имеют нормальные морфокинетические характеристики [9].
В настоящее время для выявления анеуплоидий в эмбриональных клетках применяется преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А). Внедрение ПГТ-А значительно снизило вероятность переноса эмбриона с хромосомными аномалиями в полость матки, а также частоту неудачных попыток имплантации и ранних репродуктивных потерь [10].
В начале своего развития ПГТ-А включало анализ пяти хромосом, трисомии по которым совместимы с жизнью (X, Y, 18, 13 и 21) и проводилось методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием ДНК-зондов, меченных флуорохромом. В настоящее время подтверждена низкая эффективность ПГТ-А методом FISH c биопсией эмбриона на 3-и сутки культивирования, что объясняется неполной оценкой хромосомного набора и высокой частотой недиагностированного мозаицизма, возникающего из-за ошибок деления на стадии постзиготического дробления эмбриона третьего дня развития [11]. Необходимость идентификации и анализа полного хромосомного набора привела к разработке таких новых молекулярно-генетических методов диагностики, таких как сравнительная геномная гибридизация (array сomparative genomic hybridization, aCGH), количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР) с возможностью анализа всех хромосом, высокопроизводительное секвенирование нового поколения (next generation sequencing, NGS) [12].
Метод aCGH основан на сравнении исследуемого генетического материала c эталонным образцом, что позволяет обнаружить наличие несбалансированных хромосомных перестроек и аномальное количество хромосом в исследуемых клетках. На первом этапе проводится полногеномная амплификация, далее продукты амплификации метят флуоресцентными зондами и наносят на ДНК-микрочип. С помощью лазерного сканера и специализированного программного обеспечения проводится оценка интенсивности флюоресценции. Сравнение интенсивности флуоресценции исследуемого и референсного образцов позволяет идентифицировать крупные несбалансированные хромосомные нарушения [13]. Метод aCGH стал революционным в области анализа плоидности эмбрионов; с его помощью стал возможен анализ всего хромосомного набора и выявление анеуплоидий с высокой точностью [14]. Среди недостатков метода выделяют его высокую стоимость [15].
ПГТ-А с использованием кПЦР в реальном времени позволяет определить количество копий каждой хромосомы на основании анализа ее отдельных участков, что в ряде случаев может приводить к ошибочным результатам. Для этого проводится сравнительный анализ амплификации трех или четырех специфичных локусов каждой хромосомы с эталонным геном из той же хромосомы. Преимуществами данной технологии по сравнению с aCGH являются более короткое время анализа и меньшие экономические затраты, связанные с отсутствием необходимости проведения полногеномной амплификации. Однако разрешающая способность данного метода крайне низкая в связи меньшим количеством исследуемых участков хромосом [16].
Наиболее распространенным из всех существующих в настоящее время молекулярно-генетических методов ПГТ-А является NGS. На первом этапе происходит полногеномная амплификация исследуемой ДНК, к целевым фрагментам ДНК лигируются баркодированные адаптеры, представляющие собой олигонуклеотиды с уникальными именно для данного образца последовательностями. Это позволяет проводить одновременное исследование сразу нескольких образцов в ходе одного запуска секвенатора. Способны ли технологические особенности NGS обеспечить большую точность и чувствительность анализа по сравнению с aCGH, в настоящее время является предметом острых дискуссий [17–19].
Munné S. et al. (2020) провели сравнительный анализ частоты наступления клинических беременностей на перенос при проведении ПГТ-А методами aCGH и NGS. Всего было проанализировано 6805 циклов ПГТ-А с aCGH и 1490 циклов ПГТ-А с NGS. В результате исследования была выявлена более высокая частота наступления беременности на перенос в группе пациентов с ПГТ-А методом NGS по сравнению с группой, включавшей ПГТ-А методом aCGH (85 и 71% соответственно) [19]. Однако авторы подчеркивают, что результативность программы ЭКО в расчете на цикл при сравнении двух методов была сопоставимой (63 против 59%). Аналогичные результаты были получены в исследованиях других авторов [20, 21].
Высокая разрешающая способность данного метода, возможность проведения полногеномного анализа оценки сбалансированности кариотипа, а также одновременное тестирование нескольких десятков образцов, значительно оптимизирующее экономические затраты, определяет его широкое использование в клинической практике [22]. На точность результата могут повлиять случайные ошибки полногеномной амплификации, травматизация клеток во время биопсии эмбриона, а также контаминация биопсированного материала чужеродной ДНК [14].
Способы забора биологического материала для проведения ПГТ-А включают биопсию полярных телец ооцитов и эмбрионов на стадии дробления или бластоцисты [23]. Преимуществом биопсии полярных телец является отсутствие инвазивного воздействия на эмбрион. Однако информативность данного метода значительно ниже по сравнению с биопсией эмбриона, что объясняется невозможностью исключения хромосомных аномалий отцовского происхождения, а также анеуплоидий, возникающих на стадии постзиготического дробления эмбриона [24]. Биопсия полярных телец с последующим ПГТ-А проводится исключительно в странах, где криоконсервация и генетическая диагностика эмбрионов имеют юридические ограничения. Биопсия бластомера проводится на 3-и сутки культивирования эмбрионов, при этом оптимальным является забор не более 1-й клетки. Биопсия 2 и более бластомеров ассоциирована с неблагоприятным влиянием на дальнейшее эмбриональное развитие [25]. Биопсия клеток трофэктодермы выполняется только на бластоцистах хорошего и отличного качества на 5–6-е сутки культивирования и считается наиболее предпочтительной с точки зрения информативности и инвазивности [26].
Недавнее обнаружение внеклеточной ДНК в жидкости бластоцели и культуральной среде эмбрионов послужило поводом для создания новых вариантов ПГТ-А, основанных на анализе внеклеточной ДНК из жидкости бластоцели и культуральной среды эмбрионов. Использование данных методов позволяет снизить механическое воздействие на эмбрион по сравнению со стандартным ПГТ-А с биопсией бластоцисты. Однако способна ли внеклеточная ДНК достоверно отражать кариотип эмбриона? По данным различных авторов соответствие молекулярных кариотипов внеклеточной ДНК из культуральной среды и клеток трофэктодермы варьирует от 27 до 85,7% [23]. По результатам пока еще немногочисленных исследований были получены противоречивые данные относительно информативности и целесообразности анализа ДНК, определяемой в жидкости бластоцели и культуральной среде эмбрионов. Необходимы дальнейшие исследования для определения возможности использования малоинвазивного и неинвазивного вариантов ПГТ-А в качестве надежных методов выявления анеуплоидий эмбрионов.
Показания к проведению преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии
Учитывая, что анеуплоидии эмбрионов являются наиболее частой причиной неудач имплантации и ранних репродуктивных потерь, в том числе у женщин старшего репродуктивного возраста и в случае тяжелых нарушений сперматогенеза, проведение ПГТ-А может быть рекомендовано женщинам старшего репродуктивного возраста, супружеским парам с привычным невынашиванием в анамнезе, повторными неудачами имплантации при ЭКО и тяжелой патологией спермы [27].
По мере увеличения возраста женщины наряду со снижением овариального резерва отмечается стремительное снижение качества эмбрионов. По данным Ubaldi et al. (2017), у женщин 44 лет с оптимальным овариальным резервом частота эуплоидных эмбрионов составила 14,4%, у женщин 45 лет – 45%, а у женщин 46 лет и старше все эмбрионы имели хромосомные аномалии [28].
Rubio et al. (2017) опубликовали результаты многоцентрового рандомизированного клинического исследования, включившего сравнительный анализ частоты родов в группах женщин старшего репродуктивного возраста с использованием ПГТ-A и в контрольной группе без ПГT-A. Частота родов после первой попытки переноса эмбриона в полость матки была значительно выше в группе пациенток с ПГТ-А и составила 52,9% по сравнению с 24,2% в группе контроля. Отмечалась также низкая частота ранних репродуктивных потерь в группе с ПГТ-А по сравнению с контролем (2,7 и 39,0% соответственно). При этом среднее количество переносов эмбрионов в полость матки, необходимых для достижения беременности составило 1,8 для первой группы и 3,7 – для второй [29]. Аналогичные результаты были получены в исследованиях Ubaldi F. (2017) [28], Бейк Е.П. (2018) [30], Reig А. (2020) [31]. Выявлено значительное снижение частоты ранних репродуктивных потерь, увеличение частоты живорождений и более короткое время достижения беременности при проведении ПГТ-А женщинам старшего репродуктивного возраста.
При этом, согласно результатам исследования Murphy L. et al., опубликованного в 2019 г., применение ПГТ-А в программах ВРТ у женщин младше 38 лет не оказывает положительного влияния на исходы программ ВРТ. В исследовании выявлена более низкая частота родов в расчете на пункцию по сравнению с пациентками, которым не проводилось ПГТ-А [32].
Таким образом, высокая частота образования анеуплоидных эмбрионов у женщин старшего репродуктивного возраста оказывает значительное влияние на вероятность наступления беременности в данной группе пациентов. Следует учитывать стремительное снижение количества эуплоидных эмбрионов по мере увеличения возраста женщины вплоть до полного их отсутствия. Вероятность получения хотя бы одной эуплоидной бластоцисты у женщин старшего репродуктивного возраста снижается также в связи с неоптимальным ответом на овариальную стимуляцию, снижением количества зрелых ооцитов и скорости развития эмбрионов до стадии бластоцисты. Результаты проведенных исследований указывают на целесообразность применения ПГТ-А в программах ВРТ у женщин старшего репродуктивного возраста. Исключение переноса анеуплоидного эмбриона в полость матки у женщин старшего репродуктивного возраста имеет решающее значение при достижении беременности методом ВРТ [28–31].
Доля привычного невынашивания беременности составляет примерно 5% в популяции [33]. Причины данной патологии включают генетические, анатомические, эндокринные, инфекционные, иммунологические и тромбофилические факторы; однако более чем в половине случаев причину привычного выкидыша установить не удается [34, 35]. Исследование кариотипов абортусов у женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе показало значительное увеличение частоты анеуплоидий по сравнению с таковой у женщин без самопроизвольного прерывания беременности в анамнезе [36]. По данным последних исследований, около 67% рецидивирующих самопроизвольных выкидышей ассоциированы с хромосомными аномалиями эмбрионов [36]. По мнению авторов [36], проведение ПГТ-А супружеским парам с привычным невынашиванием, связанным с хромосомными аномалиями эмбрионов, а также с идиопатическим привычным невынашиванием может улучшить результативность программ ВРТ. Несколько исследований, включавших женщин с привычным выкидышем в анамнезе, продемонстрировало снижение частоты выкидышей при проведении программы ЭКО с ПГТ-А по сравнению с естественным зачатием [35]. В исследовании Sato T. et al. (2019) не было выявлено значимых различий в частоте живорождений в расчете на одну пациентку с привычным выкидышем при проведении программы ЭКО с ПГТ-А и без ПГТ-А. Однако было выявлено увеличение частоты живорождений на перенос эмбриона и снижение частоты репродуктивных потерь в расчете на биохимическую беременность в группе пациенток с проведением программы ЭКО c ПГТ-А. Несмотря на то что применение ПГТ-А не повлияло на частоту живорождений в расчете на пациентку, оно позволило снизить количество переносов эмбрионов, необходимых для достижения родов живым плодом, в группе пациентов с привычным невынашиванием беременности [37]. Аналогичные результаты получены в исследованиях других авторов [35]. В целом проведение программы ЭКО с ПГТ-А не увеличивает частоту живорождения у женщин с привычным невынашиванием беременности, однако снижает частоту выкидышей и уменьшает время достижения беременности. Целесообразность применения ПГТ-А у данной группы пациентов обсуждается.
Согласно данным Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) от 2019 г., частота повторных неудач имплантации в программах ВРТ составляет 10–20% [38]. Основной причиной рецидивирующих неудач имплантации являются анеуплоидии эмбрионов [39]. В исследовании Cozzolino M. et al. (2020) было выявлено увеличение частоты имплантации и снижение частоты ранних репродуктивных потерь при проведении ПГТ-А у пациенток с тремя и более неудачами имплантации по сравнению с таковыми у пациенток без проведения ПГТ-А. При этом у пациенток с пятью и более неудачами имплантации в анамнезе проведение ПГТ-А не оказало значимого влияния на исходы программ ВРТ. Учитывая более высокую частоту анеуплоидных эмбрионов у пациентов с повторными неудачами ВРТ, проведение ПГТ-А для исключения переноса эмбриона с хромосомными аномалиями может быть оправдано. Тем не менее не было получено значимых различий в частоте живорождений при проведении ПГТ-А и без него [40]. Для оценки целесообразности применения ПГТ-А в данной группе пациентов необходимо проведение дальнейших исследований.
Несмотря на то что основной вклад в возникновение анеуплоидий эмбрионов вносят ошибки расхождения хромосом в мейозе у женщин, некоторые анеуплоидии могут иметь отцовское происхождение. У мужчин с аномальным кариотипом сперматозоиды, как правило, имеют несбалансированный набор хромосом. Другие факторы, такие как варикоцеле, химиотерапия в анамнезе, возраст и образ жизни пациента, также могут отрицательно влиять на мейотическое деление во время сперматогенеза [41]. В нескольких исследованиях была выявлена повышенная частота анеуплоидных эмбрионов у пациентов с тератозооспермией и олигозооспермией по сравнению с таковой при нормозооспермии [42]. В исследовании Coates et al. (2015) по результатам биопсии трофэктодермы эмбрионов и ПГТ-А методом aCGH было выявлено значительное увеличение числа аномалий половых хромосом у пациентов с олигозооспермией при использовании как донорских (1,7 против 2,0%), так и собственных ооцитов (6,1 против 5,9%) [43]. При этом клинические исходы в независимости от проведения ПГТ-А были идентичными. По результатам исследования Киселевой Ю.Ю. и соавт. (2017), была выявлена зависимость между уровнем ДНК-фрагментации сперматозоидов и кариотипом эмбрионов. При нормальном уровне фрагментации ДНК сперматозоидов частота образования кариотипически нормальных эмбрионов составила 66,17%, а при повышенном уровне фрагментации ДНК – 47,96% [44]. Однако не было выявлено статистически значимых различий в частоте эмбриональных анеуплоидий при нормальном и повышенном уровне ДНК-фрагментации. В исследовании Tarozzi N. et al. (2019) не было выявлено различий в количестве анеуплоидных эмбрионов у пациентов с патологией спермы и без нее. Однако у супружеских пар с мужским фактором бесплодия отмечался более высокий уровень мозаичных бластоцист [45]. В исследовании Gat I. et al. (2017) было продемонстрировано отсутствие корреляционной зависимости между ДНК-фрагментацией сперматозоидов и частотой образования анеуплоидных эмбрионов [46].
Получены противоречивые данные о наличии корреляции между нарушениями сперматогенеза и частотой образования анеуплоидных эмбрионов. Необходимы дальнейшие исследования для оценки целесообразности проведения ПГТ-А в данной группе пациентов.
Что касается пациенток с «хорошим прогнозом», в недавно опубликованных исследованиях было продемонстрировано отсутствие статистически значимого улучшения исходов ВРТ при проведении ПГТ-А у супружеских пар с низким риском образования анеуплоидных эмбрионов (женщины 38 лет и младше, наличие трубно-перитонеального фактора бесплодия, первая попытка ЭКО) [47].
Также были опубликованы исследования, направленные на анализ результатов ВРТ при проведении программы ЭКО с донорскими ооцитами [48, 49]. Несмотря на то что донорами ооцитов обычно являются здоровые, молодые, фертильные женщины, около 20–27% эмбрионов могут быть анеуплоидными [50]. При этом частота живорождений в программе ЭКО с донорскими ооцитами лишь на 5–10% превышает таковую при использовании собственных ооцитов, что указывает на возможную целесообразность проведения ПГТ-А данной группе пациентов [51]. Однако, согласно результатам исследования Masbou А. et al. (2019), в котором проводился сравнительный анализ клинических исходов программ ЭКО с донорскими ооцитами в зависимости от проведения ПГТ-А, не было выявлено улучшения исходов программ ВРТ при проведении ПГТ-А, хотя и наблюдалась тенденция к снижению частоты ранних репродуктивных потерь [49].
Аналогичные данные были получены в исследовании Doyle N. et al. (2020) по результатам анализа частоты живорождения в программах ЭКО с донорскими ооцитами в зависимости от проведения ПГТ-А. Частота живорождения в группе с ПГТ-А составила 53,8%, а в группе без ПГТ-А –55,8%. По-видимому, проведение ПГТ-А у супружеских пар с донорскими ооцитами не увеличивает вероятность живорождения, но, возможно, снижает риск ранних репродуктивных потерь [48].
Применение ПГТ-А в качестве рутинного дополнения к программе ЭКО все еще остается предметом острых дискуссий. Так, в 2020 г. Gleicher N. et al. [52] была опубликована критическая статья, в которой обсуждается нецелесообразность рутинного использования ПГТ-А в программах ЭКО. По мнению авторов исследования, демонстрирующие высокую эффективность применения ПГТ-А в программах ВРТ, были проведены не вполне корректно в связи с тщательно подобранными группами пациентов и несоответствующими методами статистического анализа. По мнению авторов, метод ПГТ-А, не прошедший валидацию и сертификацию регулирующими органами, не должен применяться в рутинной практике. Авторы анализируют устоявшиеся предположения, свидетельствующие о пользе ПГТ-А, и опровергают их, ссылаясь на результаты опубликованных исследований. Так, вопреки существующему мнению, авторы утверждают, что анеуплоидии хоть и вносят свой вклад в этиологию ранних репродуктивных потерь и неудач имплантации, не являются основной причиной развития последних. Это объясняется способностью бластоцист к самокоррекции, высокой частотой эмбрионального мозаицизма у человека и, возможно, представлением его в качестве варианта нормы [53]. Также авторы утверждают о невозможности исключения хромосомного мозаицизма на основании анализа нескольких биопсированных клеток [52]. По мнению авторов, результат ПГТ-А эмбриона не может отражать окончательную судьбу плоидности плода в связи с доказанной способностью бластоцисты к самокоррекции. Приводятся данные, свидетельствующие о том, что даже при беременности плодом с нормальным хромосомным набором плацента может содержать «островки» анеуплоидных клеток. Недавние исследования убедительно продемонстрировали способность бластоцисты человека к самокоррекции, что ставит под сомнение результаты предшествующей биопсии трофэктодермы [53]. Также, по мнению авторов, невозможно определение процентной доли мозаицизма всего эмбриона на основании биопсии лишь клеток трофэктодермы, которая не может исключить наличие мозаичной анеуплоидии в клетках эмбриобласта или в клетках трофэктодермы, не подвергшихся биопсии. И наконец, авторы ставят под сомнение безвредность биопсии бластомеров и клеток трофэктодермы, ссылаясь на результаты исследований, демонстрирующие высокую чувствительность эмбрионов к любым механическим воздействиям, и в качестве основной причины неудач имплантации после ПГТ-А представляют повреждение эмбрионов во время биопсии [54].
Однако, несмотря на крайне негативную оценку ПГТ-А Gleicher N. et al. (2020) [52], у метода больше сторонников, чем противников, так как его использование позволяет повысить частоту наступления беременности и родов в определенных группах пациентов.
Заключение
ПГТ-А – современный высокоинформативный метод оценки хромосомного статуса эмбриона перед его переносом в программах ВРТ. В настоящее время наиболее распространенным методом ПГТ-А является NGS, а способом получения материала – биопсия клеток трофэктодермы. ПГТ-А находится в фокусе современных научных исследований, направленных на оценку эффективности, безопасности, целесообразности применения в клинической практике и объективности результатов. ПГT-A применяется в основном при повышенном риске образования анеуплоидных эмбрионов: старшем репродуктивном возрасте женщины, повторных неудачных попытках имплантации, привычном невынашивании беременности и тяжелых нарушениях сперматогенеза. Изучение целесообразности применения ПГТ-А в группе пациентов с «хорошим прогнозом» (женщины младше 38 лет, наличие трубно-перитонеального фактора бесплодия, первая попытка ЭКО), а также в программах ВРТ с использованием донорских ооцитов требует проведения рандомизированных контролируемых исследований с качественно спланированным дизайном. Перенос мозаичного эмбриона при отсутствии эуплоидного эмбриона следует проводить только после консультации врача-генетика. Проведение рандомизированных исследований с качественным дизайном позволит найти консенсус между сторонниками и противниками ПГТ-А.
