Преэклампсия (ПЭ) – это жизнеугрожающее состояние для матери и плода. Во всем мире ежегодно ее диагностируют у 10 млн женщин, что составляет от 3 до 8% числа всех беременностей. Она является причиной смерти 76 000 беременных и 500 000 плодов и новорожденных ежегодно в мире [1–3]. В развитых странах в структуре материнской смертности ПЭ устойчиво занимает лидирующие позиции, составляя до 20% всех причин материнской летальности [4]. Тяжелая ПЭ осложняет 1,4% всех беременностей в мире. Данное состояние, как правило, развивается задолго до доношенного срока беременности, а значит, требует досрочного родоразрешения. Это приводит к рождению недоношенного новорожденного, часто с задержкой роста и со всеми последствиями недоношенности [1–4].
Нельзя не коснуться и финансового влияния ПЭ. Так, например, в США расходы на лечение ПЭ, включающее реанимационные отделения для матерей и новорожденных, последующую реабилитацию, достигают 2,18 млрд долларов, что составляет треть всех расходов на оказание помощи после родоразрешения [5].
Следующий аспект влияния ПЭ на популяционное здоровье – это отдаленные риски для матери и ребенка. Перенесенная ПЭ при беременности значимо повышает риск отдаленных сердечно-сосудистых заболеваний (инфаркта миокарда, инсульта), метаболических нарушений (сахарный диабет как I, так и II типов), внезапной смерти в дальнейшем [2, 6]. Появились данные, что гипертензивные нарушения при беременности, особенно ПЭ, значительно повышают риск ментальных расстройств в последующем у родившихся детей [7].
В настоящее время подтвержденного эффективного лечения ПЭ не существует, кроме одного – это родоразрешение, что при недоношенной беременности означает преждевременные роды и все проблемы недоношенного новорожденного, особенно с экстремально низкой массой тела. В этой связи актуальным является вопрос прогнозирования ПЭ.
Установлено, что основные патологические процессы, приводящие к развитию ПЭ, происходят еще в I триместре. Это последовательное нарушение инвазии синцитиотрофобласта, дефектное ремоделирование спиральных артерий с последующим оксидативным стрессом плаценты и дисбалансом про- и антиангиогенных факторов [1, 3, 8]. В этих ответственных этапах развития беременности принимают участие внеклеточные протеолитические ферменты – матриксные металлопротеиназы (ММП) 2, 3, 7, 9, 13 типов [9, 10], которые обладают способностью разрушать компоненты экстрацеллюлярного матрикса [10, 11]. Для успешной имплантации большую роль играют ММП, продуцируемые клетками трофобласта: ММП-2, -3, -7, -9, -13 [5, 6]; ММП-2 и ММП-9 являются ключевыми эффекторами этого процесса [9–11]. В процессе ремоделирования спиральных артерий принимают участие ММП-2, -9, -3 и -13. Они обеспечивают деградацию эндотелина и адреномедуллина, что приводит к вазодилатации спиральных артерий и становлению адекватного плацентарного кровотока в дальнейшем.
Таким образом, ряд исследований указывает на участие ММП в ключевых процессах I триместра беременности, ответственных за последующее развитие ПЭ [9–12]. В то же время на сегодняшний день нет исследований о практическом применении ММП в прогнозировании развития ПЭ. Существуют немногочисленные работы [13–15], которые подтверждают прямую корреляцию изменения уровня ММП-2 и обратную корреляцию ММП-9 с развитием ПЭ, однако они не предлагают реальных ориентиров для применения в клинической практике.
В связи с этим нами проведено исследование, цель которого – установить прогностическую роль ММП-2 и ММП-9 в развитии ПЭ и их пороговые концентрации, которые могут быть рекомендованы для практического применения.
Материалы и методы
Дизайн исследования
С целью определения прогностической значимости ММП-2 и ММП-9 как ранних маркеров ПЭ нами проведено проспективное исследование 310 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет с одноплодной беременностью. Пациентки были включены в исследование при сроке беременности 10–11 недель.
Критерии включения в исследование: наличие информированного согласия пациентки на участие в исследовании, возраст старше 18 лет, одноплодная беременность. Критерии невключения пациентов в исследование: беременность с применением вспомогательных репродуктивных технологий, многоплодная беременность, дисплазия соединительной ткани, сахарный диабет I и II типов, онкологические заболевания, аутоиммунные заболевания, наследственная тромбофилия, инфекционные заболевания (ВИЧ-инфицирование, гепатиты), прием лекарственных препаратов, психостимулирующих препаратов, курение и наркозависимость.
Всем пациенткам произведен забор венозной крови с целью определения концентрации ММП-2 и ММП-9 при гестационном сроке 11–13 недель. Забор производился одновременно с прохождением пациентками первого скринингового исследования. Пациентки находились под нашим наблюдением на протяжении всей беременности до родоразрешения. Забранные образцы крови принимались в работу после завершения беременности исследуемых пациенток.
Информированное согласие получено от каждой женщины для участия в исследовании и забора проб венозной крови. Протокол исследования № 10-17 от 16.11.2017 г. был одобрен Локальным комитетом по этике ФГАО ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет).
На протяжении исследования исключены 18 пациенток (5,8%). Из них у 6 был выявлен высокий риск хромосомных аномалий плода по результатам биохимического скрининга и неинвазивного пренатального теста. У 1 пациентки обнаружен врожденный порок у плода. В связи с этим указанным пациенткам произведено прерывание беременности по медицинским показаниям. У 11 пациенток произошел самопроизвольный выкидыш до 22 недель беременности. Преждевременными родами, не связанными с ПЭ и/или плацентарной недостаточностью, закончилась беременность у 29 пациенток (8,7%).
Диагноз ПЭ был установлен 34 пациенткам (10,9%). Из них у 20 беременных (58,8%) ПЭ была расценена как умеренно выраженная, у 14 (41,2%) – как тяжелая. Для постановки диагноза ПЭ использованы критерии Клинических рекомендаций Министерства здравоохранения Российской Федерации «Гипертензивные осложнения во время беременности, родов и послеродового периода. Преэклампсия. Эклампсия».
К умеренной ПЭ отнесены пациентки при наличии следующих критериев: артериальная гипертензия – систолическое АД 140–159 мм рт. ст. или диастолическое АД 90–109 мм рт. ст., возникшие при сроке беременности >20 недель у женщины с нормальным АД в анамнезе; протеинурия ≥0,3 г/л белка в суточной пробе мочи.
ПЭ расценена как тяжелая при наличии одного и/или нескольких критериев тяжелой ПЭ: тяжелая артериальная гипертензия с цифрами диастолического АД ≥110 мм рт. ст., систолического АД ≥160 мм рт. ст.; уровень суточной протеинурии >3 г/л, а также присоединение таких симптомов, как расстройство центральной нервной системы (нарушение зрения, головная боль), нарушение функции почек (олигурия <500 мл/сутки, повышение уровня креатинина), отек легких; внезапное появление отеков лица, рук, ног, отек зрительного диска, нарушение функции печени, боли в эпигастрии/правом верхнем квадранте живота, тромбоцитопения (ниже 100×106/л); HELLP-синдром, подтверждение страдания плода (задержка внутриутробного развития плода, маловодие, отрицательный нестрессовый тест).
Беременные с развившейся ПЭ составили основную группу – 34 пациентки. У 229 оставшихся пациенток беременность протекала без гипертензивных нарушений и закончилась своевременными родами. Из них методом простого случайного отбора вслепую были выбраны 38 пациенток, в крови которых также определяли концентрацию ММП-2 и ММП-9. Эти женщины составили контрольную группу – 38 наблюдений. Таким образом, общее количество пациенток, у которых произведен анализ уровня ММП-2 и ММП-9, – 72 беременные.
Лабораторные исследования
Забранные нами при сроке беременности 11–13 недель образцы крови указанных пациенток помещали в стерильные пробирки при температуре 4°С и центрифугировали в течение 15 мин при 1500 оборотов. После этого образцы плазмы хранили при -80°С до анализа. Анализ для определения уровня ММП-2 и ММП-9 был произведен после родоразрешения, когда пациентки были распределены по группам на основании факта развития ПЭ или неосложненного течения беременности.
Уровни ММП-2 и ММП-9 определяли, используя метод иммуноферментного анализа (ELISA) согласно протоколу производителя (Cloud-Clone Corp. Houston, USA). Использованы наборы, предназначенные для количественного определения ММП-2 (SEA100Hu, минимально обнаруживаемая концентрация 0,27 нг/мл) и ММП-9 (SEA553Hu, минимально обнаруживаемая концентрация 0,055 нг/мл) методом иммуноферментного анализа (ELISA). Забор, хранение и анализ образцов проведен согласно требованиям производителя реагентов (Cloud-Clone Corp. Houston, USA).
Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием программы IBM SPSS Statistics 26.0.
Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для описания количественных величин, имеющих нормальное распределение, использовались средние арифметические величины (M) и стандартное отклонение (SD).
В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q1; Q3).
Сравнение двух групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение при условии равенства дисперсий, выполнялось с помощью t-критерия Стьюдента. Различия показателей считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.
Оценку статистической значимости различий концентраций ММП в изучаемых группах (вследствие отсутствия признаков нормального распределения) проводили с использованием U-критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
Категориальные данные описывались с указанием абсолютных значений и процентных долей.
Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью точного критерия Фишера (при значениях ожидаемого явления менее 10).
Сравнение процентных долей проводилось при помощи критерия χ2 Пирсона.
Для оценки диагностической значимости концентрации ММП в I триместре в прогнозировании развития ПЭ применялся метод анализа ROC-кривых. С его помощью определялось оптимальное разделяющее значение количественного признака, позволяющее классифицировать пациентов по степени риска исхода, обладающее наилучшим сочетанием чувствительности и специфичности. Качество прогностической модели, полученной данным методом, оценивалось исходя из значений площади под ROC-кривой со стандартной ошибкой и 95% доверительным интервалом (ДИ) и уровня статистической значимости. Для расчета 95% ДИ долей был использован откорректированный метод Вальда.
Результаты
В целом уровень ММП-2 и ММП-9 был оценен у 72 пациенток. У 34 из них в последующем во время беременности развилась ПЭ (у 20 пациенток – умеренная ПЭ, у 14 – тяжелая ПЭ); они составили основную группу. 38 пациенток, у которых беременность закончилась своевременными родами без гипертензивных расстройств и плацентарной недостаточности/задержки роста плода, составили контрольную группу.
Клиническая характеристика
Клиническая характеристика изученных пациенток представлена в таблице 1. Средний возраст женщин в основной группе составил 30,5 (6,31) года и был статистически значимо выше, чем у пациенток контрольной группы – 25,2 (5,12) года. Индекс массы тела в основной группе оказался значимо выше (28,1 (2,73) кг/м2), чем в контрольной группе (22,9 (2,41) кг/м2) (р≤0,001).
Частота предшествующей хронической артериальной гипертензии у пациенток основной группы составила 2,9%.
В основной группе первородящие составили 23/34 (67,6%), в контрольной группе – 29/38 (77,4%); повторнородящие – 11/34 (32,4%) и 12/38 (22,6%) соответственно. Различия были статистически не значимы (р>0,05).
Следует отметить, что среди повторнородящих основной группы у 4/34 (11,8%) первая беременность также была осложнена ПЭ.
Срок родоразрешения пациенток основной группы составил 34,4 (30,7;36,1) недели, контрольной – 39,6 (38,1;40,3) недели (р<0,001).
Особенности течения ПЭ у пациенток основной группы представлены в таблице 2.
У 14/34 (41,2%) пациенток ПЭ была расценена как ранняя, т.е. развилась и потребовала родоразрешения до 34 недель беременности (28,1;33,8); у 20/34 (58,8%) – после 34 недель (35,8;39,5) – поздняя ПЭ; 14/34 (41,2%) пациенток имели симптомы тяжелого течения ПЭ.
В нашем исследовании отмечены следующие осложнения ПЭ: преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты – 2/34 (5,9%), развитие эклампсии – 3/34 (8,8%), HELLP-синдром – 3/34 (8,8%), антенатальная гибель плода – 2/34 (5,9%). У половины пациенток ПЭ сочеталась с плацентарной недостаточностью и задержкой роста плода.
Результаты исследования уровня ММП в плазме
Концентрации ММП-2 и ММП-9 при сроке гестации 11–13 недель у исследуемых беременных представлены в таблице 1.
У беременных, у которых в последующем развилась ПЭ, уровень ММП-2 в сроке беременности 11–13 недель составил 155±73,4 нг/мл и статистически значимо превышал уровень ММП-2 у беременных, у которых в дальнейшем беременность протекала без гипертензивных расстройств – 75,0±32,8 нг/мл (р<0,001) (рис. 1).
В проведенном нами исследовании отмечена статистически значимо более низкая концентрация ММП-9 в основной группе пациенток по сравнению с контрольной – 749±296 нг/мл и 1667±552 нг/мл (р<0,001) (рис. 2).
Уровень ММП-9 был снижен в основной группе по сравнению с контрольной группой, различия были статистически значимы (р<0,001).
Определение пороговых величин ММП для прогнозирования ПЭ – ROC-анализ
С целью установить прогностическое значение ММП-2 и ММП-9 в отношении развития ПЭ нами проведен ROC-анализ. Его результаты представлены в таблице 3.
Рассматривая в качестве прогностической точки концентрации ММП-2 и ММП-9 в крови при сроке беременности 11–13 недель, проведенный ROC-анализ позволил установить пороговые величины (табл. 3, рис. 3).
По результатам проведенного ROC-анализа для ММП-2 пороговая величина составила ≥102 нг/мл, которая предсказывает развитие ПЭ с чувствительностью 88,24% и специфичностью 82,76% (табл. 3). Проведенный ROC-анализ позволил нам определить концентрацию ММП-9≤980 нг/мл как пороговую для прогнозирования ПЭ с чувствительностью 77,78% и специфичностью 89,29% (табл. 3).
Обсуждение
ПЭ и сегодня остается сложной и нерешенной проблемой.
Во-первых, это осложнение и в развитых, и развивающихся странах мира не имеет тенденции к снижению. Даже при высоком уровне развития системы здравоохранения оно остается одной из ведущих причин материнской смертности [2, 4]. Во-вторых, патофизиологические механизмы, лежащие в основе ПЭ, закладываются в I триместре – за много недель до появления первых симптомов этого осложнения. Отклонения от нормального течения процессов имплантации, инвазии трофобласта, гестационной трансформации спиральных артерий, необходимых для адекватного роста и развития плода и адаптации материнского организма к беременности, – все это в дальнейшем приводит к ПЭ. В I триместре нарушения указанных процессов не имеют никаких клинических проявлений, вызывающих настороженность клиницистов. Однако беременная уже попадает в зону риска, который реализуется во второй половине беременности.
В-третьих, при установленном диагнозе ПЭ нет эффективных методов ее лечения. Единственный подход – это родоразрешение, поскольку только удаление из организма матери всех элементов плодного яйца остановит каскад запущенных многочисленных механизмов, повреждающих сосуды и органы-мишени.
В связи с вышеизложенным актуальным является поиск предикторов ПЭ с высокой специфичностью для ее прогнозирования уже с первых недель беременности. Прогнозирование ПЭ основывается на выявлении факторов риска, оценке ультразвуковых показателей и биохимических маркеров [1–3, 8].
Существующие на сегодняшний день биохимические маркеры (плацентарный фактор роста, эндотелин, плазменный протеин-13) характеризуются недостаточной чувствительностью и специфичностью [1, 3, 8].
В связи с этим актуальным является поиск ранних маркеров ПЭ с высокой чувствительностью и специфичностью, работающих уже с I триместра.
Поскольку ММП принимают участие в ключевых процессах I триместра беременности, обеспечивающих ее нормальное развитие в последующем (имплантации, инвазии трофобласта, гестационной трансформации спиральных артерий), повышение или снижение уровня ММП будет говорить о нарушении течения этих процессов. Поэтому изменение концентрации и оценка активности металлопротеиназ – предмет изучения ММП как потенциальных ранних маркеров ПЭ.
В проведенном нами исследовании мы установили, что при сроке беременности 11–13 недель в группе беременных, у которых в дальнейшем развивается ПЭ, концентрация ММП-2 статистически значимо выше, чем при физиологической беременности (155±73,4 нг/мл и 75,0±32,8 нг/мл; р<0,001).
Напротив, концентрация ММП-9 в группе беременных с последующей ПЭ оказалась значимо ниже, чем в контрольной группе: 749±296 и 1667±552 нг/мл (р<0,001) соответственно.
Известно, что ММП-2 и ММП-9 принимают участие в процессах имплантации бластоцисты. Они ответственны за разрушение коллагенового матрикса и успешную инвазию вневорсинчатого цитотрофобласта в эндометрий. Их недостаток может нарушить этот ключевой процесс беременности и в дальнейшем привести к нарушению формирования хориона и плаценты [9, 11].
Это подтверждено и результатами нашей работы.
ММП-9 участвует в гестационной перестройке спиральных артерий. Выявленный нами сниженный уровень ММП-9 у беременных с последующим развитием ПЭ подтверждает, что снижение этого фермента нарушает физиологическую трансформацию спиральных артерий, что и приводит в дальнейшем к развитию ПЭ. Поэтому снижение уровня ММП-9 в сроке гестации 11–13 недель можно рассматривать как маркер для прогнозирования ПЭ.
Ведущая роль при имплантации принадлежит ММП-2. В исследовании Lin C. еt al. изучена роль ММП-2 и ММП-9 в плаценте крыс в первые дни беременности. Исследование обнаружило корреляцию между снижением ММП-2 и ММП-9 и дефектом инвазии трофобласта, недостаточной перестройкой спиральных артерий, нарушением ангиогенеза в плаценте и накопления коллагена IV типа, что в последующем приводит к ишемии плаценты и развитию ПЭ [15].
Наше исследование выявило повышенное содержание ММП-2 в крови беременных, у которых в последующем развилась ПЭ, в 11–13 недель. Различия данных можно объяснить тем, что мы оценивали уровень ММП-2 в сроке 11–13 недель, и, возможно, в этом сроке беременности неправильно сформированная плацента уже запускает эндотелиальную дисфункцию, а ММП-2 является ее ранним и чувствительным маркером.
Данные Palei A.C. et al. согласуются с нашими результатами и указывают, что уровни ММП-2 и МПП-9 аномально повышены уже с I триместра у беременных с последующим развитием ПЭ [16].
Martinez-Fierro M.L. et al. проводили исследование ММП-2 в моче. Они показали, что ее уровень повышается уже на 12–16-й неделе у пациенток при дальнейшем развитии ПЭ. Повышение концентрации ММП-2 в 12 недель предсказывает развитие ПЭ с чувствительностью 100% и специфичностью 62,5%, а после 16-й недели – с чувствительностью 87,5% и специфичностью 74,1% [17].
Ряд исследований посвящен изучению практического применения уровня ММП для прогнозирования ПЭ во II и III триместре беременности. Так, например, Feng H. et al. [14] проанализировали не только уровень ММП-2 и ММП-9, но и их соотношение у беременных во II триместре с 20-й недели как потенциальных биомаркеров ПЭ. Авторами показано, что не отдельные показатели ММП-2 и ММП-9, а их отношение ММП-2/ММП-9 значительно выше у беременных, у которых в дальнейшем разовьется ПЭ.
Результаты нашего исследования согласуются с данными этих авторов. Нами также выявлено повышение уровня ММП-2 и снижение ММП-9, что, безусловно, приведет к увеличению их соотношения. Однако весомым преимуществом нашей работы является оценка этих биомаркеров уже в I триместре, в 11–13 недель, одновременно с пренатальным скринингом.
Следует отметить, что исследований, посвященных изучению роли ММП в I триместре беременности, немного. Многие из них проведены на животных моделях, поэтому необходимо продолжать изучение ММП-2 и ММП-9 как потенциальных маркеров развития ПЭ, на более широком клиническом материале.
Заключение
В завершение следует отметить, что в представленном клиническом исследовании мы пытались установить значение ММП-2 и ММП-9 как биомаркеров в раннем прогнозировании ПЭ, начиная с I триместра беременности.
Ключевые процессы, обеспечивающие правильное формирование плаценты и успешное течение беременности, такие как имплантация, инвазия трофобласта и последующая гестационная трансформация спиральных артерий, начинаются со срока 5–6 недель беременности и продолжаются до окончательного формирования плаценты к 18 неделям беременности.
В этой работе мы проводили забор крови у пациенток при сроке беременности 11–13 недель и определяли концентрацию ММП в плазме. Данный срок включения в исследование объясняется тем, что именно в этом сроке беременности все беременные проходят пренатальный скрининг, включающий обязательное взятие проб крови.
Следовательно, можно выделить слабое место в нашей работе – время забора биоматериала. С 5-й по 11-ю неделю беременности концентрации ММП-2 и ММП-9 могут изменяться параллельно этапам формирования плаценты.
Поэтому в настоящее время мы проводим исследование с анализом ММП в сроке беременности 5–6, 11–13 и 18–19 недель для того, чтобы установить роль каждой ММП в процессах имплантации, инвазии, гестационной трансформации спиральных артерий.
Вторым критическим замечанием к нашему исследованию является то, что мы установили значение ММП как биомаркеров ПЭ в целом, не разделяя ее на раннюю и позднюю. В клинической практике – это два разных варианта течения ПЭ. Ранняя ПЭ характеризуется большей частотой жизнеугрожающих осложнений для матери и плода, а также является более ресурсозатратной. Поэтому дифференцированное прогнозирование ранней и поздней ПЭ является актуальным. Планируется дальнейшее изучение практического применения ММП в этом вопросе. Перспективными являются специфичное прогнозирование как ранней, так и поздней ПЭ, включение в спектр исследования и других ММП, а также и их ингибиторов.
