В физиологических условиях снижение овариального резерва носит нелинейный характер, ускоряясь с возрастом. При исходном тотальном овариальном резерве (ТОР) в пределах 600 тыс. – 1 млн. примордиальных фолликулов физиологическая менопауза наступает в 49–51 год [1]. Большинство механизмов возрастного истощения фолликулярного пула неизвестны, и в случае их расшифровки и возможности блокировки репродуктивный период женщины мог бы быть продлен, по крайней мере, на 20 лет. Это было бы особенно важно для пациенток с врожденным снижением овариального резерва, у которых ТОР в 10 раз ниже (60–75 тыс. примордиальных фолликулов) и вторичная гипергонадотропная аменорея наступает в среднем в 27–33 года [2]. Возможно, в дальнейшем подобная стратегия будет реализована посредством использования коктейля Yamanaka S (белки Oct4, Sox2, KLF4 и c-Myc) [3].
Старение организма ранее объяснялось репликативной теорией (укорочение теломер, возникающее вследствие концевой недорепликации хромосом), на основе которой необратимая потеря пролиферативной активности наступает при достижении предела Хейфлика (50–52 делений) [4]. Длина теломерных участков определяет возраст клетки – чем короче теломерный хвост, тем она старше. Однако при гаметогенезе теломеры восстанавливаются. В настоящее время не менее важным, чем репликативное, считается стресс-индуцированное клеточное старение, также характеризующееся блоком клеточного цикла, приводящим к остановке механизмов пролиферации и повреждению ДНК, в результате чего запускается каскад внутриклеточных сигнальных событий, направленных на репарацию ДНК [5, 6].
В последние годы использование секвенирования нового поколения (NGS-next generation sequencing) позволило выделить несколько групп генов, принимающих участие во внутриутробном и постнатальном фолликуло- и стероидогенезе, процессах апоптоза, гормональном сигналинге и клеточном метаболизме. Особое внимание уделено генам, регулирующим механизмы мейоза и репарации ДНК (BRCA1, STAG3, MCM8 и MCM9) [7]. Из представленной генетической панели внимание исследователей в последние годы привлекает ген BRCA1, локализованный на 17 хромосоме в локусе 17q21. Данный ген вовлечен в процессы мейотического, митотического деления клеток, а также репарацию двуцепочечных разрывов ДНК, способствующих нестабильности хромосом. Согласно одной из теорий, у носительниц патогенных вариантов гена BRCA1 вследствие невозможности репарации ДНК, ооциты могут преждевременно гибнуть за счет ускоренного процесса апоптоза, приводя к преждевременному истощению овариального резерва [8, 9]. Наравне с выше представленным мнением высказывается также теория, согласно которой накопление двуцепочечных разрывов ДНК в примордиальных фолликулах препятствует нормальному их росту и созреванию, также способствуя ускоренному апоптозу с исходом в ПНЯ [10].
В популяции европейских женщин патогенные варианты гена BRCA1 встречаются крайне редко – с частотой от 0,1 до 1% и играют важную роль не только в канцерогенезе, но и ответственны за треть случаев снижения овариального резерва с возможным исходом в субклинические формы ПНЯ (оккультная и биохимическая) [11, 12]. В работе Wang E.T. et al. показано, что у носительниц патогенного варианта гена BRCA1 относительный риск выявления значения антимюллерова гормона (АМГ) ниже 1 нг/мл повышен в 4 раза (OR=4,22; 95% ДИ 1,48–12,0) [8].
Все вышеизложенное позволяет предположить роль патогенных вариантов гена BRCA1 в формировании преждевременного старения яичников с исходом в ПНЯ. Однако в доступной нам литературе в структуре генетических причин ПНЯ частота встречаемости носительства обсуждаемых генетических нарушений не представлена.
Цель исследования: выявить долю женщин носительниц патогенных вариантов гена BRCA1 среди пациенток с ПНЯ.
Материалы и методы
В одномоментное наблюдательное исследование были включены 142 женщины в возрасте от 18 до 39 лет (медиана возраста 35 лет (Q1–Q3 29–38) с ПНЯ, проходившие обследование и/или лечение в отделении гинекологической эндокринологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Диагноз был установлен на основании критериев European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) [13]. Контрольную группу составили 150 женщин со своевременной менопаузой (медиана возраста 54 года (Q1–Q3 46–71), которым проводилось BRCA-тестирование по их желанию. Исследование одобрено локальным этическим комитетом.
Критерии включения в исследование: возраст женщин на момент постановки диагноза от 18 до 39 лет; кариотип 46 ХХ; отсутствие самостоятельных менструаций в течение 4 и более месяцев; уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) более 25 мМЕ/л в двух измерениях.
Критерии исключения из исследования: наличие первичной или ятрогенной гипер-, нормо- и гипогонадотропной аменореи.
Для верификации диагноза ПНЯ оценивалось функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы на основании определения уровней ФСГ, эстрадиола (Е2), в сыворотке крови электрохемилюминесцентным методом на автоматическом иммунохимическом анализаторе Cobas е411 (Roche Diagnostics GmbH, Германия). Определение AMГ проводили с помощью набора AMH Gen II ELISE (Beckman Coulter, США).
Ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза проводилось на аппарате 2000 Toshiba SSA-240 (Япония) трансвагинальным конвексным датчиком частотой 7,5 МГц. В процессе обследования определяли расположение, размеры матки, структуру миометрия. Изучали состояние срединного М-эха. При исследовании яичников измеряли их размеры, расположение, оценивали состояние фолликулярного аппарата и стромы. Особое внимание уделяли определению объема яичников (V), который вычисляли по формуле:
V=0,523× (L×S×H),
где L – длина, S – ширина, H – толщина, 0,523 – постоянный коэффициент.
Определение наиболее частых патогенных вариантов гена BRCA1: 185delAG, 4153delA, 5382insC, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 300T>G (Cys61Gly), 2080delA, ассоциированных с риском развития рака молочной железы и яичников, проводили с использованием набора реагентов «ОнкоГенетика BRCA» и детектирующего амплификатора ДТПрайм производства «ДНК-Технология», Россия. Выявление генетических патогенных вариантов в гене BRCA1 осуществлялось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени и последующим анализом кривых плавления продуктов амплификации.
Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 2.8.8 (ООО «Статтех», Россия).
Количественные показатели проверялись на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка (при числе исследуемых менее 50) или критерия Колмогорова–Смирнова (при числе исследуемых более 50).
В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы, нижнего и верхнего квартилей – Me (Q1; Q3).
Доверительный интервал для доли проверяли на возможность приближения к нормальному распределению. Так как наблюдаемая доля оказалась слишком мала, использовали точные доверительные интервалы для долей. Для этого воспользовались биномиальным распределением по методу Уилсона (Wilson).
Результаты
При BRCA-тестировании 142 женщин с ПНЯ нами выявлены два случая носительства патогенных вариантов этого гена (локусы 3819del GTAAA и 5382insC), что составляет 1,4% (95% ДИ 0,4–5,0%) в структуре изучаемой патологии. Обнаруженные варианты классифицируются как патогенные в соответствии с критериями American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) [14]. В контрольной группе вышеуказанных патогенных вариантов выявлено не было.
Результаты клинического и гормонального обследования 142 женщин с ПНЯ показали, что медиана возраста менархе составила 13 лет (Q1–Q3 12–14). У большинства женщин (88%, 125/142) до дебюта заболевания был регулярный менструальный цикл. Медиана возраста дебюта заболевания составила 31 год (Q1–Q3 23–36). Длительность вторичной аменореи – от 8 месяцев до 23 лет.
На момент постановки диагноза ПНЯ индивидуальный анамнез по раку не был отягощен ни в одном случае. Семейный анамнез был отягощен по раку молочной железы в 7,7% (11/142). Фиброзно-кистозная болезнь выявлена в 14,8 % (21/142).
Данные гормонального профиля представлены в таблице.
Медиана объема правого яичника составила 1,8 см3 (Q1–Q3 1,3–2,73), левого – 1,7 см3 (Q1–Q3 1,2–2,6).
Для выявления особенностей репродуктивного анамнеза у двух носительниц патогенных вариантов гена BRCA1 был проведен детальный анализ их клинического и гормонального статуса. В первом случае у пациентки П., 36 лет, патогенный вариант был обнаружен в локусе 3819del GTAAA в гетерозиготном состоянии и унаследован по материнской линии. У сибса и родственниц 1–2 линии родства – отягощенная наследственность по раку (молочная железа, яичники). При анализе репродуктивного статуса больной было выявлено, что менархе наступило в 14 лет, цикл был регулярным до 34 лет, после чего появились задержки менструаций до 3 месяцев. В анамнезе две беременности, двое родов, гормональную контрацепцию не получала. Дебют заболевания в 35 лет. Уровень ФСГ составил 44 Мме/л, АМГ – менее 0,14 нг/мл, Е2 – 77 пг/мл. При УЗИ органов малого таза объем правого яичника – 1,5 см3, левого – 3,2 см3, фолликулы не определяются. В связи с выраженной двусторонней фиброзно-кистозной мастопатией, подтвержденной магнитно-резонансной томографией молочных желез, пациентке была произведена двусторонняя профилактическая подкожная мастэктомия с одномоментной алломаммопластикой. Гистологическое исследование ткани молочных желез: фиброзирование стромы правой молочной железы, без атипии клеток. Очаговая типичная протоковая пролиферация левой молочной железы. Согласно рекомендации маммолога, заместительную гормональную терапию не получает.
Во втором случае у пациентки С., 44 лет, патогенный вариант гена BRCA1 был обнаружен в локусе 5382insC. Уровень ФСГ составил 25 Мме/л, АМГ – менее 0,14 нг/мл, Е2 – 8 пг/мл. При УЗИ органов малого таза объем правого яичника – 2,7 см3, левого – 1,6 см3, фолликулы единичные. У родственниц 1–2 линии родства – отягощенная наследственность по раку молочной железы. При анализе репродуктивного статуса больной выявлено, что менархе наступило в 13 лет, цикл был регулярным до 38 лет, затем наступила стойкая аменорея. В анамнезе бесплодие на протяжении 10 лет при регулярной половой жизни, гормональную контрацепцию не получала. В связи со стойким бесплодием, на фоне 4 лет ПНЯ, согласно рекомендациям ESHRE, больной был произведен перенос донорского эмбриона в полость матки. В 18 недель – поздний самопроизвольный выкидыш. Через 4 месяца после выкидыша по данным УЗИ молочных желез выявлен BIRADS4b, в связи с чем, была проведена трепанобиопсия опухолей наружных локализаций молочной железы и лимфатических узлов. Гистологическое заключение биоптата: инвазивный рак молочной железы неспецифического типа, Grade 3 (атипичный медуллярный рак). Иммунофенотип трижды негативного подтипа рака молочной железы, базальный фенотип. Произведена позитронно-эмиссионная и компьютерная томография – наличие активной опухолевой ткани в правой молочной железе, отдаленные метастазы не выявлены. На первом этапе лечения пациентке был проведен 6-месячный курс химиотерапии с последующей двусторонней радикальной подкожной мастэктомией с одномоментной маммопластикой большой грудной мышцы в комбинации с нижним деэпидермизированным кожным лоскутом и эндопротезом. Гистологическое заключение исследования ткани молочных желез: онкоцитарная аденокарцинома правой молочной железы, Grade 3 (1 см). Секреторный рак правой молочной железы, Grade 1 (0,7 см), ypT1b(m)N0 (0/12).
Обсуждение
В проведенном нами исследовании при BRCA-тестировании 142 пациенток с ПНЯ выявлено два случая носительства патогенных вариантов этого гена, что составило 1,4% в структуре изучаемой патологии.
Ввиду отсутствия в доступной нам литературе работ, посвященных частоте встречаемости носительства патогенных вариантов гена BRCA1 при ПНЯ, не представляется возможным проведение сравнительного анализа частотных показателей. Общая распространенность патогенных вариантов гена BRCA1 в популяции крайне низкая и составляет 0,1–0,5%, однако при раке молочной железы и яичника она достигает 5–10 и 5–17% соответственно [15, 16]. В нашем исследовании у пациенток с ПНЯ в одном случае был выявлен гетерозиготный патогенный вариант 3819del GTAAA, в другом – встречающийся с 90% частотой от всех случаев патогенных вариантов 5382insC [17]. Носительницы обсуждаемых генетических нарушений не отличались от не носительниц по среднему возрасту наступления менархе, характеру менструального цикла и гормональному профилю. Обращает на себя внимание более поздний дебют заболевания у пациенток с патогенными вариантами гена BRCA1 (35 и 38 лет, против медианы возраста дебюта заболевания 31 год в основной группе), в связи с чем, продолжительность эстрогенной депривации у них была несколько короче в сравнении с не носительницами. У этих пациенток была отягощена, наследственность по раку молочной железы у родственников 1–2 степени родства; в то время как в группе неносительниц патогенных вариантов гена BRCA1 подобная отягощенность встречалась в 6,3% случаев (9/140).
Вклад гена BRCA1 в механизм формирования ПНЯ можно рассмотреть с позиции его роли в уменьшении примордиального пула. Экспериментально доказано, что у нокаутных по гену BRCA1 мышей, в программе стимуляции суперовуляции созревает ограниченное число ооцитов и значительно снижается численность помета. Это объясняется не только ускоренным процессом апоптоза, но и накоплением мейотических ошибок, приводящих к анеуплоидиям. У мышей-носителей гетерозиготных патогенных вариантов гена BRCA1 в дальнейшем формируется фенотип преждевременного старения яичников с развитием отдаленных последствий стойкого эстрогенного дефицита по типу остеопороза и эндотелиальной дисфункции [10, 18]. Высказанная Oktay K. et al. гипотеза о возможной роли патогенных вариантов гена BRCA1 в генезе формирования субклинической формы преждевременного старения яичников (уровни ФСГ менее 12 мМе/л) нашла свое подтверждение в результатах многочисленных морфологических и клинико-гормональных исследований [12].
В работе Phillips K.A. et al. было показано, что у носительниц патогенных вариантов гена BRCA1 уровень АМГ был на 25% ниже по сравнению с не носительницами (95% ДИ 5–41%; р=0,02), и с большей вероятностью находился в самом нижнем возрастном квартиле (ОШ 1,84; 95% ДИ 1,11–303; р=0,02). Использование авторами квадратичной модели, доказало, что биологический возраст пациенток с патогенными вариантами опережает их хронологический возраст на 2 года (37 против 35 лет). Это позволило авторам сделать предположение о повышенном риске развития ранней менопаузы у носительниц патогенных вариантов гена BRCA1 [19]. Еще более убедительные данные были получены в исследовании, продемонстрировавшем, что у носительниц данной мутации старше 35 лет риск снижения уровня АМГ менее 0,5 был в 10 раз выше, чем у носительниц до 35 лет (ОШ 10,8; р=0,001; 95% ДИ 2,53–45,9) [20].
Полученные результаты о вкладе гена BRCA1 в генез формирования ПНЯ нашли окончательное подтверждение в исследовании Ben-Aharon I. et al., в котором у носительниц патогенных вариантов гена BRCA1, помимо статистически значимого снижения АМГ, на морфологическом уровне доказано двукратное уменьшение плотности залегания примордиальных, первичных, вторичных и антральных фолликулов в корковом слое яичника, подтверждающее снижение овариального резерва. Впервые авторами дополнительно у этой категории пациентов определялись биомаркеры системного старения – интерлейкин 1А (IL1A), фактор роста фибробластов 23 (FGF23) и белок Klotho. В обсуждаемой работе была выявлена тенденция к снижению показателя Klotho и повышению уровней IL1a и FGF23 (P=0,006). IL1A продуцируется эндотелиальными клетками и, являясь провоспалительным цитокином, способствует развитию кардиоваскулярной патологии. Морфогенетический белок Klotho, экспрессируемый, в основном, сосудистым сплетением головного мозга, а также, частично — тканью яичника, активирует FGF23. Изменения этих показателей ассоциируются с прогрессированием сердечно-сосудистой патологии (артериальная гипертензия и атеросклероз), а снижение уровня белка Klotho позиционируется в качестве предиктора уменьшения продолжительности жизни. Полученные результаты позволили cделать вывод о том, что у носительниц патогенных вариантов гена BRCA1 старение организма в целом можно рассматривать как «зеркальное отражение» старения яичников [21].
Механизмы повреждения и репарации ДНК играют существенную роль не только в канцерогенезе, но и в процессах старения, ассоциированного с клеточным и окислительным стрессом. Носительницы патогенных вариантов гена BRCA1 могут быть предрасположены к преждевременному старению организма с исходом в эндотелиальную дисфункцию и сопряженную с ней сердечно-сосудистую патологию (инфаркт, инсульт, ишемическая болезнь сердца), при которой фенотип ПНЯ является лишь одним из проявлений системного старения. Нельзя, впрочем, исключить и альтернативный вариант, при котором патогенные варианты в гене BRCA1 приводят к функциональному повреждению яичников вследствие преждевременного старения герминативных клеток, что, в свою очередь, вызывает типичные клинические проявления, характерные для менопаузы — остеопороз и сердечно-сосудистые заболевания. Более того, наиболее вероятным представляется существование обоих описанных механизмов, реализация каждого из которых связана с некими модифицирующими факторами. Все вышеизложенное позволяет сформулировать новую парадигму о связи между патогенными вариантами гена BRCA1, ускоренным старением гонад и старением организма в целом.
Заключение
Таким образом, носительство патогенных вариантов гена BRCA1 ассоциировано не только с повышенным риском развития онкопатологии в целом, но и со снижением овариального резерва и эстрогенной депривацией. Выявление данной закономерности требует пересмотра принципов канцеропревенции у пациенток с ПНЯ, так как ранее считалось, что у этой категории больных крайне низкий риск развития рака молочной железы, яичников и эндометрия. Клиницистам важно помнить, что при преждевременном снижении овариального резерва необходимо проводить не только первичный стандартный онкологический скрининг, но и тщательно собирать семейный онкологический анамнез с последующим обоснованным назначением генетического BRCA-тестирования. С другой стороны, BRCA-тестирование постепенно становится распространенной скрининговой процедурой, особенно среди пациенток с отягощенным онкологическим семейным анамнезом, что позволяет при получении положительного результата обследования заранее проявить настороженность в отношении риска развития преждевременного старения яичников у этой категории больных.
