Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) – патологическое состояние, характеризующееся прекращением функциональной активности яичников у женщин в молодом возрасте (до 40 лет)
и проявляющееся вторичной аменореей, высокими уровнями гонадотропинов в крови, бесплодием
и симптомами эстрогенного дефицита. В отсутствие хирургической овариэктомии, химиотерапии или
лучевой терапии на область малого таза синдром ПНЯ охватывает гетерогенный спектр состояний,
включающий стертые формы дисгенезии гонад, резистентность к гонадотропинам и аутоиммунное
поражение яичников. При этом как зарубежные, так и отечественные авторы признают, что в большинстве случаев причина данного заболевания остается неизвестной и ПНЯ, таким образом, у многих пациентов рассматривается как идиопатическое заболевание [17, 18]. Согласно ранее проведенным исследованиям в России [1, 5] по выявлению различных форм ПНЯ, в 4,2–5,6% случаев наблюдаются численные аномалии половых хромосом, включая и мозаичные их варианты, в 13,9–26,4%
обнаруживаются генные нарушения (неслучайная инактивация Х-хромосомы или премутация гена
FMR1), в 14,9–15,2% выявляется аутоиммунная этиология, а на долю идиопатической формы ПНЯ
приходится 52,8–67,0% случаев [1, 5]. Несмотря на это, встречаемость семейных форм заболевания примерно у каждой 3–4-й пациентки приводит к выводу о большей значимости генетических
факторов в генезе преждевременного истощения фолликулярного пула, а появление и широкое внедрение новых молекулярно-цитогенетических методов на сегодняшний день позволяют значительно расширить диапазон знаний о данной патологии.
Исходя из всего выше сказанного, целью нашего исследования явилось изучение половых хромосом в интерфазных ядрах клеток гонад у больных с ПНЯ и дисгенезией гонад с помощью флуоресцентной in situ гибридизации.
Материал и методы исследования
В ранее опубликованной нами работе описаны результаты исследования половых хромосом в гонадах у 24 пациенток с ПНЯ [4]. В настоящем исследовании мы расширили основную группу больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах до 29 человек (средний возраст – 31,3±4,9 года), а также изучили половые хромосомы у 2 пациенток с ПНЯ и нарушенным кариотипом в лимфоцитах (средний возраст – 29,0 ±3,0 года): у одной больной выявлен кариотип 47,ХХY, у другой – мозаицизм 45,Х/46,ХХ [5]. Кариотип в лимфоцитах исследовали с помощью стандартного цитогенетического анализа (G-окраска). Средняя продолжительность аменореи у больных в основной группе составила 4,4±3,6 года, средние уровни ФСГ в сыворотке крови – 114,1±34,9 МЕ/л, средние уровни эстрадиола – 70,7±43,9 пмоль/л. Дополнительно половые хромосомы в клетках гонад были исследованы у 3 пациенток с первичной гипергонадотропной аменореей (средний возраст – 27±8 лет), среди которых у 2 пациенток выявлен нормальный кариотип (46,ХХ) в лимфоцитах и у 1 – регулярная форма моносомии Х-хромосомы. Группа контроля была представлена 10 аутопсийными образцами яичниковой ткани, полученными от молодых женщин в возрасте 21–35 лет (в среднем 29,1±5,6 года), погибших при чрезвычайных обстоятельствах. Гистологическое исследование яичниковой ткани подтвердило наличие в ней желтых тел и нормального числа фолликулов, находившихся на разных стадиях развития, что позволило косвенно судить о нормальной функциональной активности данных яичников. У трех больных с ПНЯ дополнительно были исследованы половые хромосомы в клетках эндометрия, и у двух больных (у одной пациентки с ПНЯ и у одной больной с синдромом Шерешевского–Тернера [СШТ]) проведен FISH-анализ половых хромосом в лимфоцитах. Подготовку материала гонадной ткани и проведение FISH анализа осуществляли аналогично описанным ранее [4].
Статистический анализ осуществлен с помощью расчета критерия хи-квадрата и двухвыборочного
t-теста с различными дисперсиями. В качестве статистически значимых учитывали связи с параметром p<0,05.
Результаты исследования
В результате исследования половых хромосом в ткани яичников среди 29 больных с ПНЯ основной группы у 72,4% (21/29) пациенток обнаружены различные типы гонадного мозаицизма по половым хромосомам (см. таблицу).
Анализ распределения клеточных клонов в яичниках у этих больных позволил установить, что у 51,7% из них (15/29) в гонадной ткани имела место одна анеуплоидная клеточная линия, представленная в 31% (9/29) случаев моносомией Х и в 20,7% (6/29) случаев трисомией Х-хромосомы, при этом анеуплоидия была обнаружена в 2–10% и 1–10% проанализированных клеток соответственно. У 20,7% (6/29) оставшихся пациенток был обнаружен мозаицизм с наличием нескольких различных клеточных линий с аномальным хромосомным набором. У 10,3% (3/29) пациенток выявлено наличие двух аномальных клеточных линий: в двух случаях – сочетание моносомии с трисомией Х в 13% клеток и в одном случае – сочетание трисомии с тетрасомией Х-хромосомы в 11% клеток яичника. У 10,3% (3/29) других пациенток нами были обнаружены три клона клеток с анеуплоидией половых хромосом. Две из них имели сочетание моно-, три- и тетрасомии Х, встреченных в 16–26% клеток. У третьей пациентки выявлено сочетание моносомии Х в 38% клеток, трисомии Х в 3% клеток и наличие в 30%
клеток яичников Y-хромосомы. Стоит особо подчеркнуть, что у данной пациентки на фоне сохраненного до 25 лет ритма менструаций при гистологическом исследовании биоптата гонады была
обнаружена ткань яичников с единичными фолликулами и фиброзными телами.
У пациентки с ПНЯ и кариотипом 47,ХХY в лимфоцитах в гонадах мозаицизма обнаружено не было – все проанализированные гонадные клетки содержали две Х- и одну Y-хромосому.
У другой пациентки с ПНЯ и мозаичным кариотипом 45,X/46,XX в лимфоцитах в клетках гонад также был обнаружен мозаицизм, однако доля распределения и состав клеточных клонов различались.
У всех трех пациенток с первичной аменореей в яичниковой ткани выявлены различные анеуплоидные клеточные линии. Среди двух пациенток с нормальным кариотипом в лимфоцитах крови в одном случае в гонадах обнаружена одна анеуплоидная линия клеток с Х-моносомией, а в другом – несколько линий с наличием клеток с моно- и трисомией Х, а также в 2% клеток была обнаружена Y-хромосома. У пациентки с регулярной формой 45,Х в лимфоцитах в гонадах только 20% клеток имели одну Х-хромосому, в 28% клеток выявлено две Х-хромосомы, в 2% клеток – три Х-хромосомы и в 50% клеток была обнаружена одна Х- и одна Y-хромосома.
В интерфазных ядрах клеток 10 образцов контрольных яичников в 80% (8/10) случаев все проанализированные клетки содержали две Х-хромосомы. В двух (20%) образцах обнаружен тканевой мозаицизм: в одном случае присутствовала моносомия Х-хромосомы (в 39% клеток атрезирующегося
фолликула), в другом – трисомия Х в 9% клеток яичника. Таким образом, при сравнительном анализе частоты выявления мозаицизма в ткани яичников у больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах периферической крови (72,4%, 21/29) и у больных с дисгенезией гонад (100%, 3/3) относительно контрольной группы с высокой степенью статистической значимости (p<0,003) было
подтверждено, что у женщин с преждевременным истощением фолликулярного пула значительно
чаще наблюдаются существенные межтканевые (определенные в лимфоцитах и соматических
клетках яичников) различия представленности половых хромосом.
У 3 (пациентки № 13, 20 и 21) из 8 (27,6%) пациенток основной группы с обнаруженным высоким
уровнем гонадного мозаицизма (от 10% и выше) половых хромосом в яичниках мы дополнительно
исследовали половые хромосомы в ткани эндометрия, т. к. эндометрий является производным
энтодермы подобно корковому веществу яичника. В ткани эндометрия у всех трех больных выявлено
не более 2% клеток с моносомией Х, остальные исследованные клетки содержали две X-хромосомы. У пациентки № 21 с наличием Y-хромосомы в 30% клеток яичника в эндометрии ни одной клетки
с Y-хромосомой обнаружено не было.
Стоит особо подчеркнуть, что у данной (3,4%, 1/29) пациентки с ПНЯ и у 2 (66,6%, 2/3) больных с дисгенезией гонад в ткани гонад FISH-методом обнаружены клетки с Y-хромосомой, в то время как в лимфоцитах крови с помощью стандартного цитогенетического анализа у двух больных были определены кариотип 46,ХХ и у третьей больной кариотип 45,Х. Исходя из этих данных, у двух пациенток с высокой долей клеток с Y-хромосомой (30 и 50%) в яичниковой ткани мы провели дополнительное исследование половых хромосом в лимфоцитах крови также FISH-методом. Результаты
исследования показали, что в лимфоцитах у этих больных имеет место лишь низкий уровень мозаицизма по анеуплоидии Х-хромосомы (от 2 до 2,8%) и отсутствует хромосома Y.
Сравнительный анализ клинико-лабораторных характеристик больных с ПНЯ с наличием или отсутствием мозаицизма половых хромосом в яичниковой ткани показал отсутствие достоверных
различий.
Обсуждение
Мозаицизм, в отличие от полной формы анеуплоидии, как правило, возникает вследствие нерасхождения хромосом при делении эмбриона. Если это событие происходит на ранних этапах
внутриутробного развития, доля анеуплоидных клеток будет значительной, если же нарушение
сегрегации хромосом имеет место в более поздний период онтогенеза, организм будет иметь
низкий уровень мозаицизма или анеуплоидная клеточная линия будет присутствовать не во всех
типах тканей организма. Индивидуумы с низким уровнем мозаицизма по Х-хромосоме, как правило,
не имеют каких-либо клинических проявлений заболевания, а при наличии ограниченного тканевого мозаицизма возможно развитие стертых форм нарушений в органах, сформированных из этих тканей.
Не вызывает сомнений, что для нормального функционирования яичников необходимо наличие двух
интактных Х-хромосом, т. к. давно доказано полное отсутствие активности гонад у больных с СШТ, развивающимся при моносомии Х-хромосомы. Данные литературы о том, что у больных с СШТ существование наряду с Х-моносомией нормальной клеточной линии (46,ХХ) способствует более частому наступлению самостоятельного менархе и даже беременности [21], наводят на мысль о возможности наличия у больных с ПНЯ и нормальным кариотипом Х-моносомной клеточной линии, которую в ряде случаев крайне сложно выявить стандартными цитогенетическими методами. Известно, что в норме возможно обнаружение в крови низкого уровня мозаицизма Х-хромосомы. Так, частота моносомии Х в лимфоцитах у здоровых женщин репродуктивного возраста в некультивированных лимфоцитах составляет от 0,5 до 1,0%, в культивированных лимфоцитах – от 0,7 до 3,8% [3], а с возрастом частота моносомии Х-хромосомы у здоровых женщин линейно увеличивается примерно на 700 на 106 клеток в год [8, 15]. Было показано, что у больных с ПНЯ в периферической крови выявляется достоверно более высокий средний уровень Х-моносомных лимфоцитов относительно не только здоровых женщин репродуктивного возраста (5,00 против 2,42), но и пожилых женщин с своевременной менопаузой (5,00 против 3,55). При этом у пациенток с ПНЯ увеличения Х-моносомных клеток с возрастом не наблюдается [8]. Эти данные позволяют предположить существование у больных с ПНЯ изначально заложенной определенной доли клеток с моносомией Х. Все вышесказанное приводит к выводу, что FISH-анализ половых хромосом в лимфоцитах крови должен си стематически использоваться и быть включенным в перечень обязательных обследований для исключения низкого уровня мозаицизма Х-хромосомной анеуплоидии у пациенток с ПНЯ.
Продолжая поиск этиологических факторов ПНЯ, в нашей работе мы сконцентрировали свое внимание на изучении численных аномалий половых хромосом у этой категории больных непосредственно
в клетках яичника также с помощью FISH-анализа. В результате исследования у 72,4% пациенток при
нормальном кариотипе в лимфоцитах обнаружен ограниченный гонадами мозаицизм по половым хромосомам, который с высокой степенью статистической значимости (p=0,003) отличался от результатов исследования в контрольной группе (20% случаев наличия мозаицизма). Более того, в группе сравнения у всех трех больных с первичной аменореей в гонадах был выявлен мозаицизм с присутсвием от 4 до 72% анеуплоидных клеток. Наши результаты исследования половых хромосом в гонадах у больных с дисгенезией гонад подтверждают ранее проведенное исследование, когда у 4 пациенток с дисгенезией гонад и отсутствием мозаицизма (кариотипы 46,ХХ и 46,XY) в крови при изучении половых хромосом в ткани гонад с помощью стандартной G-окраски и FISH-метода в 100% случаев выявили гонадный мозаицизм с наличием клеточной линии 45,Х в 17–65% клеток. В результате исследования авторы выдвинули гипотезу о том, что ведущей причиной дисгенезии гонад является не ранее доминирующая теория об аутосомно-рецессивном наследовании, а численные нарушения половых хромосом, возникающие непосредственно в закладках гонад в процессе деления, дробления и морфогенеза органов эмбриона [19]. Подобные результаты были получены и ранее [6, 20].
Таблица. Результаты сравнительного исследования половых хромосом методами G-окраски
в лимфоцитах и FISH в гонадах у пациенток с ПНЯ, дисгенезией гонад и в контрольной группе.
Что касается механизмов преждевременного истощения овариального резерва с последующим прекращением функции яичников, то целесообразно описать процессы формирования и гибели фолликулярного аппарата у плодов с нормальным (46,ХХ) и анеуплоидным кариотипом (45,Х). Доказано, что в сроки от 14 до 20 нед беременности в нормальном яичнике апоптозу подвергается около 3% оогониев и ооцитов [14], в 22 нед, по разным данным, – от 4 до 10%, а после 27 нед этот процесс становится более интенсивным и к 35–40-й нед доля дегенерирующих ооцитов возрастает до 17% [2, 12]. В то же время в яичниках плодов с моносомией Х-хромосомы процесс апоптоза в 15 недель затрагивает 50%, а в 20 нед – 70% первичных половых клеток. В срок 22 недели у этой категории плодов вообще не обнаружено ни одного ооцита [14].
Исходя из представленных данных, можно предположить, что у пациенток с ПНЯ и выявленной анеуплоидией по половым хромосомам в яичниковой ткани с помощью FISH-анализа, по-видимому,
срабатывает аналогичный механизм преждевременной гибели фолликулов из примордиального пула.
Однако ускоренный процесс апоптоза у этих пациенток, видимо, запускается не в антенатальном, а в
постнатальном периоде либо затрагивает лишь анеуплоидные клетки, что приводит к недостаточному
фолликулярному резерву уже к пубертату.
На частоту выявления скрытого мозаицизма в основном влияют 4 фактора: тип и число анализируемых тканей, число исследуемых клеток, чувствительность используемого метода и возможная естественная селекция против аномальной клеточной линии [9]. В нашем исследовании у 31 больной с ПНЯ и 3 пациенток с дисгенезией гонад мы исследовали две ткани: лимфоциты периферической крови анализировали с помощью стандартной G-окраски, а ткань яичников – с использованием FISH-метода.
При этом клетки гонадной ткани были исследованы в интерфазе без предварительного ультивирования; следовательно, результат отражал реальное распределение клеточных клонов in vivo. Исходя из этого, а также в связи с отсутствием данных литературы о возможности существования низкого уровня мозаицизма по Х-хромосоме непосредственно в яичниках у здоровых лиц мы расценивали как значимые даже минимальные нарушения. В нашей контрольной группе только 2 женщины из 10 имели нарушения плоидности Х-хромосомы в яичниковой ткани. При этом, несмотря на нормальное гистологическое строение контрольных образцов яичниковой ткани и наличие в них многочисленных фолликулов, все же остался неизвестным гинекологический и репродуктивный анамнез этих женщин, а также у них не проводили исследования кариотипа по лимфоцитам, что не исключает наличия у этих женщин генерализованного мозаицизма и его патологичности.
Мы провели исследование половых хромосом в гонадной ткани с помощью высокоточного молекулярно-генетического метода, а кариотип в лимфоцитах был оценен с помощью стандартной G-окраски, который не обеспечивает достоверной информации вследствие нечувствительности к выявлению клеточных линий с пропорцией патологических клеток менее 10% [16, 19]. У 6 из 29 больных с ПНЯ в гонадной ткани выявлено более 10% клеток с нарушенной плоидностью Х-хромосомы, в то время как по лимфоцитам был определен 46,ХХ кариотип с отсутствием мозаицизма. Наши результаты подтверждаются также ранее опубликованными данными о значительных межтканевых различиях по кариотипу в изученных клеточных линиях у больных с СШТ [9, 16]. К тому же у трех пациенток с ПНЯ, нормальным кариотипом в лимфоцитах крови при относительно высоком уровне (≥10%) анеуплоидных клеток мы дополнительно провели оценку представленности половых хромосом в клетках эндометрия, где мозаицизм с наличием Х-моносомии имел место не более чем в 2% клеток. Полученные данные подтверждают предположение о т существующее мнение о влиянии на личия и распределения аномальных клеточных клонов на фенотип, т.к. помимо недостаточности яичников, мы не выявили других признаков СШТ.
Стоит особо подчеркнуть, что в 3,4% случаев при ПНЯ и в 66% – при различных формах дисгенезии гонад с помощью FISH-анализа в 20% клеток яичника нами была обнаружена Y-хромосома, не выявляемая в лимфоцитах даже при использовании FISH-метода. При этом известно, что риск развития гонадной опухоли у женщины при выявлении Y-хромосомного материала в лимфоцитах крови, по данным различных авторов, составляет от 7 до 27,5% в возрасте около 30 лет с последующим увеличением этого риска с годами [10]. Мы не нашли данных литературы касательно выявления Y-хромосомы только в клетках яичника в отсутствие таковой в лимфоцитах у больных с ПНЯ.
Имеются некоторые исследования, подтверждающие выявление Y-хромосомы в гонадах у больных
с полной формой 45,Х в лимфоцитах [7, 11], однако не существует данных относительно риска развития гонадобластомы у таких больных. К тому же в биоптатах яичниковой ткани наших пациенток даже при высокой доле Y-позитивных клеток при гистологическом исследовании не были обнаружены элементы тестикул. Исходя из всего вышесказанного, мы не проводили повторную лапароскопию с целью гонадэктомии, а сочли целесообразным ограничиться постоянным динамическим наблюдением
за данными пациентками.
Отражение Х-хромосомного мозаицизма на клинических признаках их носительниц описано в литературе, однако данные остаются спорными, особенно в случаях с низким уровнем мозаицизма 45,Х/46,ХХ и 47,ХХХ/46,ХХ, и точное влияние низкого уровня мозаицизма Х-хромосомы на функцию яичников неизвестно. У пациенток с ПНЯ и обнаруженной высокой долей Х-моносомных клеток в периферической крови не определено какой-либо корреляции между уровнем мозаицизма 45,Х в крови и возрастом возникновения ПНЯ [13]. Авторы впервые предположили, что состав Х-анеуплоидных клеток может различается в лимфоцитах и яичниках и именно хромосомная конституция гонадных клеток определяет возраст наступления вторичной аменореи. Нам также не удалось выявить какого-либо влияния гонадного мозаицизма на клиническую картину заболевания у больных с ПНЯ.
Таким образом, для больных с ПНЯ характерны различные виды численных нарушений половых хромосом в гонадной ткани. Это позволяет предположить, что одним из ведущих механизмов преждевременного истощения овариального пула при данной патологии может быть ускоренный апоптоз ооцитов, идентичный таковому при типичной форме дисгенезии гонад.
