Проблема бесплодного брака имеет широкое распространение по всему миру, что отражается на высокой активности внедрения вспомогательных технологий (ВРТ) в репродуктивную медицину. Благодаря таким современным методам, как интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ), дополнительный отбор зрелого сперматозоида по связыванию с гиалуроновой кислотой (ПИКСИ), преимплантационный генетический скрининг (ПГС), позволяющий провести анализ полного хромосомного набора, возросла частота наступления беременности [1].
Однако это не решает полностью проблем негативных исходов программ ВРТ, так как частота наступления беременности не превышает 50%, даже при наличии нормальных ультразвуковых параметров прегравидарного эндометрия и эуплоидного хромосомного набора переносимого эмбриона [2].
Используемые в настоящее время системы классификации эмбрионов опираются на морфологию и были разработаны вскоре после первой успешной беременности после ЭКО. Их точность по-прежнему остается недостаточной [3].
Перенос эмбрионов производится на основании визуальной оценки их морфологического качества, что имеет ограниченную прогностическую ценность для определения вероятности наступления и прогрессирования беременности [4], так как не отражает их хромосомного набора. В дальнейшем не все эмбрионы «хорошего» морфологического качества успешно имплантируются [5], в связи с этим возникает необходимость развития и внедрения в практику клиницистов новых методов повышения результативности лечения в программе ЭКО путем селективного переноса в полость матки эмбриона с высоким потенциалом к имплантации [4].
Самым известным альтернативным методом выбора эмбриона является проведение ПГС, который используется уже более десяти лет, показывая превосходство над отбором по морфологическим критериям [5].
ПГС численных или структурных хромосомных аномалий – это инструмент для тестирования эмбриона, направленный на выявление эуплоидных эмбрионов в когорте полученных во время цикла ЭКО. Одним из важнейших негативных аспектов этой технологии является потенциальное воздействие, которое может оказывать сама биопсия на эмбрион [6], а наличие его мозаицизма является основным ограничивающим фактором в интерпретации результатов [7]. Это поднимает вопрос о том, является ли биопсия бластомеров точным изображением хромосомного набора зародыша в целом, учитывая возможность самокоррекции и селективного апоптоза эмбрионов раннего развития [8]. К тому же необходимо совершенствование современных подходов для обеспечения понимания биологических процессов, лежащих в основе неудач имплантации эуплоидных эмбрионов [9].
В настоящее время большое внимание уделяется развитию неинвазивных методов оценки жизнеспособности эмбрионов человека в программах ЭКО [10].
Анализ метаболизма при культивировании эмбрионов на моделях с животными показал ценность маркеров успешной имплантации после переноса. Следует рассмотреть, как особенности метаболизма эмбриона человека могут влиять на потребление питательных веществ, и каким образом это соотносится со способностью эмбриона к имплантации [11].
Очевидно, оценка физиологических процессов будет играть огромную роль в выборе эмбриона для селективного переноса в полость матки, а анализ окружающей культуральной среды представляет собой уникальный источник для изучения [12].
В последние годы становится популярным анализ метаболизма эмбрионов, культивированных в лабораторных условиях, при помощи высокочувствительных аналитических методов точного обнаружения специфических молекул для выявления связи с морфологией, успешной имплантацией и дальнейшим развитием беременности. В основном внимание ученых сосредоточено на изучении метаболизма основных субстратов: аминокислот, глюкозы и пирувата [13].
При анализе метаболизма пирувата было показано, что повышенное его потребление эмбрионом коррелирует с развитием до стадии бластоцисты [14].
В 2008 году D. Gardner с соавт. в своей работе продемонстрировал взаимосвязь между потреблением питательных веществ человеческим эмбрионом, его потенциалом к имплантации и дальнейшему развитию после переноса в полость матки [12].
Исследование потребления глюкозы проводилось методом микрофлуориметрии и показало, что уровень потребления глюкозы был выше в культуральных средах эмбрионов, после переноса которых развилась беременность, по сравнению с теми эмбрионами, после переноса которых беременность не наступила: на 4-е сутки – 82,0±4,9 и 50,3±4,4 пмоль/эмбрион/ч, на 5 сутки – 182,1±20,6 и 90,8±11,6 пмоль/эмбрион/ч соответственно. Интересно отметить, что на 4-й день наблюдалось увеличение потребления глюкозы эмбрионами женского пола на 28% по сравнению с эмбрионами мужского пола. Наблюдаемые половые различия в метаболизме глюкозы на стадии раннего эмбрионального развития подтверждают гипотезу о том, что мужские и женские человеческие эмбрионы различны по своей физиологии
Таким образом, экспресс-скрининг метаболизма глюкозы в культуральных средах человеческих эмбрионов на 4-е и 5-е сутки развития может оказаться полезным для разработки алгоритма селективного переноса в полость матки.
На основании спектроскопиии ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия) можно определить состав и структуру молекул в биологическом образце и их количество. Современные методы ЯМР-спектроскопии могут обнаружить даже наименьшее содержание пространственной структуры белков. Это позволяет производить анализ биологических материалов без их разрушения для дальнейшего исследования с помощью других аналитических методов, что дает подробную качественную и количественную информацию об образце [13].
В 2008 г. в работе E. Seli с соавт. были показаны данные неинвазивного профилирования метаболома культуральных сред с помощью протонного ЯМР, определяющие репродуктивный потенциал эмбриона [3]. Полученный с помощью ЯМР метаболомный профиль культуральных сред коррелирует с репродуктивным потенциалом эмбрионов. Так, определенная с помощью ЯМР концентрация глутамата была значительно выше в культуральных средах имплантировавшихся эмбрионов. Аналогичным образом индекс жизнеспособности, рассчитанный по результатам ЯМР с использованием коэффициентов глутамата и аланин/лактата, был выше для эмбрионов, после переноса которых развилась беременность и произошли роды. Протонная ЯМР-спектроскопия позволяет определить жизнеспособность отдельных эмбрионов с чувствительностью 88,2%.
Поскольку большинство биологических функций выполняют белки, важно изучить динамику протеома во время эмбрионального развития и его ответ на внутренние и внешние воздействия.
В 2008 году F. Dominguez и соавт. использовали микрочипы, содержащие 120 белковых антител, для анализа секретома – группы белков, поглощаемых или секретированных бластоцистами человека [15]. Концентрация белков CXCL13 (хемоаттрактант В-лимфоцитов), stem cell factor (фактор роста стволовых клеток), TRAILR3 (цитокин семейства факторов некроза опухоли), MIP-1β (макрофагальный воспалительный белок-1β) и MSP-α (белок, стимулирующий макрофаги) значительно уменьшилась в образцах сред культивирования бластоцист по сравнению с контрольными образцами сред, в которых не производилось культивирование. Авторами было высказано предположение, что снижение экспрессии указывает на потребление этих белков бластоцистами. Содержание фактора некроза опухоли-1 и интерлейкина-10, напротив, значительно увеличилось в представленных образцах сред.
Кроме того, при сравнении образцов сред от имплантировавшихся и неимплантировавшихся бластоцист содержание CXCL13 и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (granulocyte macrophage colony-stimulating factor) было значительно ниже в средах имплантировавшихся эмбрионов, полученных в циклах ЭКО.
Масс-спектрометрический анализ образцов культуральных сред эмбрионов всех стадий развития и остановившихся в развитии в исследовании M.G. Katz-Jaffe показал, что каждый последующий этап эмбрионального развития отличался секретомным профилем. Отсутствие биомаркера с молекулярной массой 8,5 кДа (предположительно, убиквитина) в средах культивирования дегенеративных эмбрионов и высокое его содержание в средах культивирования развивающихся бластоцист указывают на его прямую связь с потенциалом к имплантации [10].
Известно, что убиквитин участвует в ряде физиологических процессов, включая пролиферацию, апоптоз и имплантацию [16]. Было показано, что повышенная секреция убиквитина в биологических жидкостях отмечается при некоторых заболеваниях белкового обмена [17, 18].
Пептид с молекулярной массой 16-кДа – лептин, был обнаружен R.R. Gonzalez с соавт. в средах культивирования бластоцист при изучении взаимодействия между эмбрионом и внутриматочным эпителием при имплантации [19]. Помимо процессов нарушения жирового обмена молекула лептина участвует во многих процессах, связанных с репродуктивными функциями, эмбриональным развитием и иммунным ответом. Полученные данные указывают на то, что лептин может также играть важную роль в имплантации эмбрионов.
Считается, что в окно имплантации лептин инициирует и устанавливает молекулярный диалог с его рецепторами в эндометрии [20], а также активно производится трофобластом и модулирует инвазию клеток [19]. Показано, что перспективные бластоцисты человека секретируют в культуральную среду лептин в более высоких концентрациях [21].
В нескольких публикациях сообщается о присутствии лейкоцитарного антигена человека (HLA-G) в отработанных средах культивирования и его ассоциации с морфологическим качеством эмбриона и успешным исходом беременности. Оценка данного показателя в сочетании с морфологической оценкой представляет собой неинвазивный маркер для прогнозирования качества эмбриона и успешной имплантации [22].
Однако полученные результаты не были абсолютными, так как в другом многоцентровом исследовании был получен широкий диапазон концентраций HLA-G, но только в одной из трех клиник была установлена значимая связь между успешной имплантацией и содержанием HLA-G в средах культивирования эмбрионов [23].
Другое же исследование D. Kotze с соавт. в 2010 г. не установило какой-либо связи между уровнем HLA-G и успешной имплантацией. Интересно отметить, что частота прерывания беременностей в первом триместре была значительно ниже при отборе эмбриона по уровню HLA-G и морфологическим критериям по сравнению только с морфологическим отбором [24].
Таким образом, анализ секретируемых в культуральную среду веществ не только способствует пониманию физиологических процессов, характерных для разных этапов развития, но и служит основой для разработки неинвазивного метода определения жизнеспособности эмбрионов [10].
Масс-спектрометрия является одним из наиболее часто используемых методов качественного и количественного анализа молекулярного состава биологических образцов. Масс-спектрометрия в сочетании с современными методами хроматографии является высоко чувствительным методом и позволяет обнаружить в образце метаболиты в очень низких концентрациях [13].
Альтернативным подходом анализа культуральных сред является спектрометрия в ближней инфракрасной области (БИК-спектрометрия). C. Vergouw с соавт. провели исследование, показавшее, что данный метод позволяет отобрать эмбрионы, способные к успешной имплантации, по корреляции между профилем метаболитов, секретируемых эмбрионами, и наступлением беременности [4]. В исследование были включены 333 женщины в возрасте до 38 лет, имеющие хороший ответ на стимуляцию в анамнезе и проходившие лечение в программе ЭКО по «короткому» и «длинному» протоколам с последующим селективным переносом эмбриона.
Выбор эмбриона для селективного переноса производился на основании морфологических критериев оценки на 2–3-и сутки культивирования, после чего среды их культивирования были исследованы методом спектрометрии в ближней инфракрасной области.
Успешным исходом программы считалась констатация сердцебиения плода и развитие беременности до 12 недель гестации. Спектральный анализ показал уникальный метаболический профиль, который коррелирует с репродуктивным потенциалом эмбриона.
В результате проведенного исследования были обнаружены значимые различия по показателю жизнеспособности между положительным и отрицательным исходами беременности (р<0,03). Методом логистической регрессии были выявлены факторы, влияющие на исход беременности, которыми явились возраст матери, процент фрагментации и показатель жизнеспособности эмбриона.
Степень корреляции определялась при помощи точных вычислений, в которых достоверность оценки жизнеспособности эмбриона по метаболическому профилю на 3-и сутки культивирования составила 53,6%, а по морфологическому критерию отбора – 38,5%.
Существует предположение о том, что человеческие эмбрионы могут секретировать во внеклеточную среду специфические микроРНК, анализ которых может позволить прогнозировать успешность имплантации. Однако исчерпывающих данных до настоящего времени не накоплено. Тем не менее, исследование культуральных сред эмбрионов во время проведения циклов ЭКО предоставляет уникальную возможность для определения содержания микроРНК и выявления неинвазивных маркеров имплантационного потенциала эмбриона [25].
МикроРНК (англ. microRNA, miRNA) – малые некодирующие молекулы РНК длиной 18–25 нуклеотидов (в среднем 22), обнаруженные у растений, животных и некоторых вирусов, принимающие участие в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов путем РНК-интерференции [26–28].
МикроРНК были открыты В. Амбросом, Р. Ли и Р. Фейнбраум в 1993 г., а к настоящему моменту описаны уже тысячи микроРНК человека и других видов, разработаны различные методы их изучения, созданы онлайн-базы данных последовательностей микроРНК (например, miRBase) [29].
МикроРНК связаны с многочисленными биологическими процессами, в том числе с развитием, ростом и дифференцированием клеток, а дифференциальная экспрессия определенных микроРНК коррелируют с различными заболеваниями, в том числе раком и сахарным диабетом, а так же бесплодием [30–32]. Они были обнаружены практически во всех биологических жидкостях, включая грудное молоко, амниотическую жидкость, слезы и слюну, спинномозговую, плевральную и перитонеальную жидкость, кровь, сперму и мочу. Следовательно, существует большая заинтересованность в определении микроРНК в пределах этих жидкостей для обнаружения биомаркеров, направленных на раннее выявление заболеваний. Необходимо полное понимание биологической роли микроРНК в раннем развитии эмбриона человека [33].
Специфические микроРНК, обнаруженные в питательной среде, коррелируют со способом оплодотворения ЭКО или ИКСИ, плоидностью и живорождением [34].
B. McCallie и соавт., E. Rosenbluth и соавт. в своих работах выделили 135 микроРНК, секретируемых бластоцистами человека [25, 32]. Это включает 39 уникальных микроРНК эмбриона, характерных для эуплоидных и анэуплоидных эмбрионов, а также 21 микроРНК, определяющие половую принадлежность [25].
Исследование Е. Rosenbluth демонстрирует содержание hsa-miR-191 в культуральных средах анэуплоидных эмбрионов, а высокие концентрации микро-РНК-191, hsa-miR-372 и hsa-miR-645 в свою очередь определялись в средах культивирования неимплантировавшихся эмбрионов. Кроме того, обнаружено, что концентрация микроРНК в образцах сред культивирования 5 суток развития была более высокой по сравнению с 4 и зависела от способа оплодотворения (ЭКО или ИКСИ) [35].
Важна роль бластоцисты в регуляции самых ранних этапов имплантации, нарушение которых приводит к бесплодию и повторным неудачным попыткам ЭКО. Например, значимое изменение уровня экспрессии hsa-miR-661 наблюдается исключительно в когорте неимплантировавшихся эмбрионов, что было подтверждено индивидуальным анализом образцов методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени [36].
Полученные данные демонстрируют, что человеческие бластоцисты выделяют микроРНК, участвующие в регуляции процессов имплантации, что может быть использовано для выявления биомаркеров имплантационного потенциала эмбрионов.
Анализ образцов культуральных сред, собранных от эмбрионов разных этапов предимплантационного развития (стадия дробления, морулы, бластоцисты), показал, что 96,6% микроРНК, обнаруженных в культуральных средах, были секретированы именно клетками трофоэктодермы. К тому же состав образцов от зигот и морул не имел значимых различий, поэтому данное исследование применимо исключительно для бластоцист.
Анализ профиля микроРНК культуральных сред эуплоидных имплантировавшихся и неимплантировавшихся бластоцист выявил наличие специфических микроРНК (hsa-miR-20а, hsa-miR-30с), значимое увеличение экспрессии которых было связано с успешной имплантацией.
Полученные профили специфических микроРНК в культуральных средах имплантировавшихся и неимплантировавшихся эуплоидных бластоцист использовались как биомаркеры для селективного переноса эмбриона в полость матки [30].
Е. Rosenbluth и соавт. изучили 754 микроРНК, определенных в бластоцистах. Наибольшая концентрация hsa-miR-372, hsa-miR-720 и hsa-miR-302c определялась в 27 бластоцистах. Эти исследователи демонстрируют, что человеческие бластоцисты выделяют большое количество микроРНК, которые имеют большое значение для выживания и развития зародыша [37].
К тому же эмбрионы мужского пола секретируют hsa-miR-518d-5Р в 5,6 раза больше по сравнению с эмбрионами женского пола, что предполагает некоторую степень половой дифференциация уже на стадии бластоцисты. Это говорит о том, что микроРНК может быть ранним индикатором прогноза исхода программы ВРТ уже на 5-й день развития.[38].
Показана уникальная выраженность экспрессии 11 микроРНК (hsa-miR-15b, hsa-miR-18а, hsa-miR-184, hsa-miR-195, hsa-miR-20b, hsa-miR-212, hsa-miR-222, hsa-miR-367, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-518a-3p, hsa-miR-93), секретированных бластоцистами, полученных при культивировании эмбрионов молодых женщин, в отличие от бластоцист, полученных от женщин старшего репродуктивного возраста [39].
Многократные неудачные попытки ЭКО – сложное психоэмоциональное, финансовое и физическое испытание, несущее за собой негативный опыт для пациентов.
Среды культивирования эмбрионов различных стадий развития являются уникальным объектом исследования, так как несут в себе информацию об энергетической, метаболической активности и состоянии сигнальных систем эмбриона, о чем свидетельствуют имеющиеся в литературе публикации. Однако противоречивость некоторых полученных результатов требует дальнейших исследований, включающих совокупность популярных методов спектроскопии, масс-спектрометрии и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в программах ЭКО (ИКСИ) с проведением ПГС для определения ассоциации исследуемых показателей с качеством, плоидностью эмбрионов и их потенциала к имплантации.
Таким образом, дальнейшие исследования и оценка молекулярных составляющих питательных сред являются перспективным направлением в поиске маркеров успешной имплантации эмбриона с последующим развитием клинической беременности и рождением здорового ребенка для повышения эффективности лечения при использовании методов ВРТ.
Научно обоснованные данные о молекулярном составе сред культивирования позволят разработать дополнительный неинвазивный способ выбора эмбриона для селективного переноса, что позволит создать алгоритм индивидуального ведения женщин в программах ВРТ.
