В патогенезе гестоза большое значение имеет нарушение обмена липопротеинов низкой (ЛПНП)
и очень низкой плотности (ЛПОНП), претерпевающих химические модификации и токсически воздействующих на клетки материнского организма. Показано, что при гестозе в сыворотке крови
увеличиваются концентрации ЛПНП и ЛПОНП и их окисленных форм. Отмечено, что патогенез гестоза характеризуется вовлечением клеток иммунной системы в патологический процесс. Выявленное нами ранее активированное состояние моноцитов периферической крови беременных при гестозе [1] позволяет предположить , что миграция моноцитов в стенку сосуда и их последующая дифференцировка в пенистые клетки могут способствовать развитию системной эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся нарушением целостности стенки сосуда в результате эрозии эндотелиального слоя, тромбогенеза и нарушения микроциркуляции.
В настоящее время недостаточно изучен механизм вовлечения моноцитов периферической крови
в индукцию эндотелиальной дисфункции при гестозе в условиях нарушения липидного обмена. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови из аутологичной сыворотки крови беременных при физиологически протекающей беременности и гестозе.
Материал и методы исследования
Обследованы 52 женщины во время и вне беременности. В 1-ю группу вошли 20 беременных
с гестозом различной степени тяжести в III триместре беременности без признаков угрожающего
прерывания беременности на момент исследования. Диагноз гестоза был установлен на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности по балльной системе по классификации Г.М. Савельевой. 2-ю группу составили 20 женщин с физиологическим течением беременности (срок гестации 32–39 нед). В 3-ю группу включили 20 здоровых небеременных женщин без гиперлипидемии и признаков атеросклероза. Возраст женщин 1-й и 2-й группы колебался от 20 до 39 лет и в среднем составил 29,2±5,5 и 29,5±4,8 года соответственно. Распределение по степени тяжести гестоза: среди беременных 1-й группы у 85,5 % пациенток имелся гестоз легкой степени, у 11,1% – гестоз средней степени тяжести и у 3,7 % женщин – гестоз тяжелой степени. Чаще всего встречались отеки беременных и повышение артериального давления – в 77,7% случаев, патологическая прибавка массы тела обнаружена у 59,5% пациенток, протеинурия – у 22,2%. У беременных с гестозом наиболее распространенными заболеваниями были нейроциркуляторная дистония по смешанному и гипертоническому типу и заболевания щитовидной железы (25,9±8,4%),
однако частота этих заболеваний у женщин с гестозом и с физиологическим течением беременности достоверно не различалась. В то же время хронические воспалительные заболевания верхних дыхательных путей и заболевания органов дыхания в 1-й группе встречались достоверно чаще (74,07±8,4%; p< 0,05). При анализе частоты и характера гинекологических заболеваний у женщин 1-й
группы выявлено, что урогенитальные инфекции в анамнезе имелись у 48,2±9,6% пациенток, воспалительные заболевания придатков – у 18,5±7,4%. Частота планового оперативного родоразрешения была выше в контрольной группе беременных (57,9 %), однако случаи экстренного кесарева сечения встречались только у беременных с гестозом (37,5 %), что достоверно отличало данные группы пациенток (p<0,01). Все роды были своевременными, а масса новорожденных соответствовала параметрам доношенных детей и в среднем составила 3321±421,3 г. Гипотрофия плода встречалась в обеих группах пациенток: у 3 (7,4±5,03%) беременных 1-й группы и у 2 (6,6±6,4%) женщин 2-й группы. Обвитие пуповины вокруг шеи плода и по типу портупеи встречалось только в группе беременных с гестозом и обнаружено в 29,6±8,7%, нарушение мозгового кровообращения инфекционно-гипоксического генеза было выявлено только в группе беременных с гестозом у 2 (7,4±5,03%) детей. Хроническая компенсированная и субкомпенсированная плацентарная недостаточность по результатам патоморфологического исследования выявлена в обеих группах беременных без достоверных отличий, однако в 1-й группе достоверно чаще (p<0,05) наблюдались воспалительные изменения в плаценте (85,1±6,8%). Оценку интенсивности поглощения липидов
моноцитами периферической крови проводили методом окраски липидов с помощью красителя OIL RED O [16]. Выделение мононуклеаров из гепаринизированной периферической крови проводили на градиенте плотности фиколлверографин. Полученные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ICN, США). Клетки от каждого пациента (3·106 клеток на лунку в 1 мл среды) помещали в 2 лунки стерильного предметного стекла (BD, США) и культивировали при 37 °С 3 ч. Затем лунки отмывали от неприлипших лимфоцитов
раствором Хенкса, в каждую лунку добавляли 1 мл среды. Через сутки инкубации из каждой лунки отбирали 500 мкл среды и добавляли в первую лунку 500 мкл ЭТС (контроль), а во вторую лунку с клетками того же пациента 500 мкл аутологичной сыворотки крови (опыт). Через сутки инкубации все лунки отмывали раствором Хенкса, фиксировали 10% раствором формалина 10 мин, отмывали дистиллированной водой 15 мин, промывали 70% изопропанолом 10 мин и окрашивали 0,25% раствором OIL RED O (ICN, США) в 70% изопропаноле 10 мин. Затем промывали препараты дистиллированной водой 10 мин, окрашивали гематоксилином 5 мин, промывали дистиллированной водой и фиксировали в глицерин-желатине. Анализ площади экспрессии липидных включений проводили в 50 полях зрения (х630) с помощью микроскопа Nikon Eclipse 400 и программы Морфология 4.0. Полученные данные по площади экспрессии липидов в каждом поле зрения делили на количество ядер и умножали на 100. Из полученных значений площади экспрессии липидов в клетках, проинкубированных в присутствии аутологичных сывороток крови, вычитали значение площади экспрессии липидов, полученное для тех же клеток, но проинкубированных в обычной среде с добавлением 500 мкл ЭТС. Статистический анализ проводили с помощью критерия Манна–Уитни с использованием программы Statistica 7.0.
Результаты исследования и обсуждение
Интенсивность поглощения липидов из аутологичной сыворотки моноцитами/макрофагами
периферической крови, полученных от беременных с гестозом, была достоверно выше, чем поглощение липидов моноцитами/макрофагами периферической крови из аутологичной сыворотки, полученных от беременных с физиологически протекающей беременностью и здоровых небеременных женщин. Необходимо отметить, что поглощение липидов из ЭТС моноцитами/макрофагами периферической крови как у здоровых беременных, так и у беременных с гестозом находилось на одном уровне и было существенно ниже поглощения липидов из аутологичной сыворотки крови (таблица, рис. 1–3, см. на вклейке).
Ранее на культуре перевиваемых эндотелиальных клеток EA.Hy926 нами установлено, что поглощение липидов эндотелиальными клетками из сыворотки крови беременных с гестозом было выше [площадь экспрессии 6,35±0,55% (n=30)], чем из сыворотки крови здоровых беременных [площадь экспрессии 2,43±0,28% (n=20), p<0,01] и здоровых небеременных женщин [2,7±0,49% (n=10), p<0,01]. Поглощение липидов эндотелиальными клетками из ЭТС было незначительным – 0,68±0,28% (n=20) [2].
Таким образом, усиленное поглощение липидов из сывороток беременных с гестозом вело к образованию пенистых клеток из моноцитов периферической крови и из эндотелиальных клеток. Сыворотки здоровых беременных не вызывали такого эффекта.
Полученные нами данные можно объяснить повышенным содержанием в сыворотке крови беременных с гестозом модифицированных или окисленных ЛПНП или ЛПОНП, что ранее описано в литературе [4]. Вместе с тем нельзя исключать наличия в сыворотке крови беременных с гестозом факторов, способствующих поглощению как нативных, так и модифицированных липидов моноцитами/макрофагами.
Такими факторами могут являться провоспалительные цитокины и активные формы кислорода, секретируемые тканью плаценты при гестозе. Указанные факторы активируют материнские лейкоциты, проходящие вместе с кровотоком через матку [15]. В результате стимуляции лейкоциты выделяют активные формы кислорода, увеличивают экспрессию адгезионных молекул. Снижение активности антиокислительной системы при гестозе, накопление активных кислородных радикалов в зоне маточно-плацентарного кровообращения [12, 17] способствуют образованию пероксидов липидов, которые повреждают клеточные мембраны, увеличивая поглощение холестерола, окисленных свободных жирных кислот и ЛПНП [3].
Обнаруженное нами повышение поглощения липидов моноцитами/макрофагами, сопровождающееся образованием пенистых клеток, а также обнаруженное ранее повышение поглощения липидов эндотелиальными клетками [2] при гестозе в условиях нарушения обмена липидов [8] могут вносить определенный вклад в индукцию эндотелиальной дисфункции. Активированное состояние моноцитов периферической крови беременных при гестозе [1] и хемоаттрактантные компоненты липидов могут способстовать миграции моноцитов в субэндотелиальное пространство, где под влиянием различных цитокинов, ростовых факторов и липопротеинов моноциты/макрофаги превращаются в пенистые
клетки [5, 14].
Моноциты вследствие увеличения адгезивности эндотелия и повышенной экспрессии собственных лигандов для связывания адгезионных молекул проникают в интиму. Циркулирующие моноциты имеют мало или не имеют скэвенджер-рецепторов, но их количество возрастает с дифференцировкой в макрофаги [10]. Тканевые макрофаги конститутивно экспрессируют на своей поверхности скэвенджер-рецепторы [9], обеспечивающие поглощение модифицированных липопротеинов [6]. Действуя на макрофаги, окисленные ЛПНП повышают секрецию этими клетками провоспалительных цитокинов [11] и металлопротеиназ, усиливают их цитотоксичность, ингибируют экспрессию NO-синтазы, изменяют внутриклеточный метаболизм липидов, обеспечивая их накопление [7, 13]. В свою очередь IL-1β, TNF-α и M-CSF, секретируемые макрофагами, активируют эндотелий и гладкомышечные клетки, способствуя развитию повреждения стенки сосуда. В условиях нарушения
липидного обмена при гестозе поглощение липидов моноцитами/макрофагами и эндотелиальными клетками может способствовать развитию системной эндотелиальной дисфункции и нарушению целостности стенки кровеносных сосудов матери. Это предположение подкрепляется тем, что повреждения децидуальных сосудов при гестозе характеризуются фибриноидным некрозом сосудистой стенки и накоплением загруженных липидами пенистых клеток.
Таблица. Поглощение липидов моноцитами переферической крови.
Выявленное нами повышенное поглощение липидов моноцитами/макрофагами и эндотелиальными клетками может способствовать развитию дисфункции эндотелиальных клеток беременной женщины, что в итоге может приводить к таким патологическим проявлениям гестоза, как отеки и гипертензия. Полученные нами данные свидетельствуют о незначительной информативности оценки только лишь
липидного спектра сыворотки крови у беременных женщин. Даже при отсутствии изменений липидного спектра [2] сыворотка крови беременных женщин с гестозом способна инициировать
накопление моноцитами/макрофагами и эндотелиальными клетками липидов. Предложенный
нами функциональный тест оценки способности моноцитов периферической крови образовывать
пенистые клетки в присутствии аутологичной сыворотки крови наряду с оценкой липидного спектра сыворотки крови может использоваться в акушерской практике с целью раннего прогнозирования развития гестоза у беременных женщин.
Работа поддержана грантом Президента РФ № НШ-1066.2008.
