Анализ морфологии ооцитов, полученных в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) — необходимый и важный этап успеха цикла преодоления бесплодия. Особо пристального внимания заслуживают патологии цитоплазматического компартмента, которые, по некоторым данным, являются индикаторами генетических, эпигенетических и метаболических дефектов, индуцирующих патологическое развитие эмбрионов человека [1].
Грубозернистая центрально выраженная деструкция цитоплазмы ооцита — достаточно редко встречаемая аномалия женских половых клеток, которая может поражать как всю когорту ооцитов, так и некоторые. В настоящий момент опубликовано несколько работ, посвященных изучению ооцитов с центрально расположенной гранулярностью [1, 2, 3]. S. Kahraman с коллегами не выявили корреляции между центрально расположенной гранулярностью ооцитов и дальнейшим развитием эмбрионов за исключением количества развивающихся беременностей, которое оказалось значительно ниже в группе ооцитов с гранулярностью. Авторы предполагают, что гранулярность служит признаком цитоплазматической незрелости. Данная аномалия может поражать как все ооциты пациентки, так и некоторые из полученной когорты, при этом у некоторых женщин во всех попытках ЭКО ооциты имеют данную патологию, независимо от протокола стимуляции суперовуляции.
B. Balaban с коллегами, напротив, отмечали снижение выживаемости после криоконсервации и нарушение развития эмбрионов, полученных из ооцитов с центральной гранулярностью [1]. Van Blerkom (1995) показал, что ооциты MII с грубозернистой деструкцией цитоплазмы имеют более низкий внутриклеточный рН, содержание аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и часто анеуплоидный набор хромосом с их рассеиванием [3]. Авторы связывают появление аномалии ооцитов с гипоксией фолликулов.
Однако ни в одной из описываемых работ не провели электронно-микроскопического исследования данной патологии. Это представляет несомненный интерес для эмбриологов и репродуктологов и было проведено в настоящем исследовании.
Материал и методы исследования
Пациентка Л., 31 год обратилась с жалобами на отсутствие беременности в течение 5 лет при регулярной половой жизни без предохранения. Менструальный цикл регулярный. Беременностей не было, гормональное исследование — без особенностей, при ультразвуковом исследовании органов малого таза патологии не выявлено, фолликулярный аппарат в обоих яичниках выражен. У мужа (31 год) нормозооспермия. В анамнезе одна попытка ЭКО по короткому протоколу, в которой получено 2 ооцита, перенос не производили из-за отсутствия эмбрионов хорошего качества. Поставлен диагноз: Бесплодие первичное, трубноперитонеальный фактор.
Супружеской паре было проведено лечение бесплодия по программе ЭКО-ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) по короткому протоколу на фоне агониста гонадотропин-рилизинг гормона (диферелин 0,1 мг). Контролируемую овариальную стимуляцию проводили пурегоном 300 МЕ/сут в течение 5 дней, затем менопуром 225 МЕ/сут в течение 10 дней. Триггер овуляции — прегнил в дозе 10 000 МЕ. При трансвагинальной пункции фолликулов получено 11 ооцитов, из которых 2 находились на стадии MII (метафаза II), 6 — MI (метафаза I), 3 — GV (герминальный везикул). Все аспирированные ооциты при их оценке на световом уровне (×100) после очищения от клеток кумулюса с помощью энзимной денудации (гиалуронидаза, СООК Medical, Дания) имели выраженную центральную гранулярность (рис. 1, см. на вклейке). Эмбриологический этап выполняли на культуральных средах COOK (СООК Medical, Дания). Из двух зрелых ооцитов оплодотворение произошло только в одном (пронуклеусы с периферическим распределением проядрышек, отсутствие центрации), однако дробление зиготы отсутствовало. Перенос эмбриона отменен. Незрелые ооциты были зафиксированы в день аспирации и отправлены на ультраструктурное исследование.
Ооциты для электронно-микроскопического исследования готовили согласно El-Shafie [4]. Кратко, ооциты фиксировали в растворе Карновски (pH 7,4) в течение 24 ч, затем отмывали в какодилатном буфере (pH 7,4). Отмытые ооциты обрабатывали тетроксидом осмия с последующей процедурой обезвоживания в этаноловых спиртах восходящей концентрации (по 10–15 мин в каждом растворе): 30, 50, 70, 96, 100%, 100%+пропилен оксид. Все манипуляции с ооцитами проводили с помощью полимерных микропипеток (Биомедикал, Россия) в стеклянных 4-луночных планшетах для культивирования клеток. Затем препараты заключали в смесь Эпона и Аралдита. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB-5 с последующим контрастированием по Рейнольдсу и просматривали на электронном микроскопе Hitachi H500.
Результаты исследования
Из-за трудности изучения ультроскульптуры ооцитов человека в качестве образца для сравнения брали микрофотографии из издания M. El-Shafie [4].В результате проведенного электронно-микроскопического исследования ооцитов выявлена картина неравномерного распределения основных цитоплазматических органелл. В центральной области цитоплазмы на месте гранулярности обнаружено скопление набухших гипертрофированных гранул гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР), окруженных митохондриями. Большие вакуоли ГЭР иногда сливаются с формированием вакуоли с негомогенным содержимым. В анализируемых ооцитах митохондрии округлые или овальные диаметром от 0,5 до 0,8 мкм с электронно-плотным матриксом. Митохондрии имеют кристы, нерегулярно размещенные по периферии параллельно внешней мембране. Однако многие митохондрии содержат вакуолизированный матрикс, что указывает на снижение их метаболического потенциала, уменьшение выработки АТФ. В комплексах ГЭР+митохондрии последние часто малочисленны и дегенерированы (рис. 4, см. на вклейке). Сами цистерны ГЭР неравномерно распределены и скапливаются группами с большими промежутками между собой. Сегрегация цитоплазматических комплексов ГЭР+митохондрии наблюдается только в области гранулярности.
В кортексе ооцитов присутствует небольшое количество электронно-плотных кортикальных гранул, расположенных вблизи оолеммы, а также небольшие гранулы ГЭР, окруженные митохондриями, с гомогенным содержимым и без такового (рис. 2, см. на вклейке).
Субкортекс представлен комплексами ГЭР+митохондрии, в том числе измененными, а также диффузно расположенными митохондриями как повышенной плотности, так и вакуолизированными. Присутствуют трубочковые агрегаты ГЭР, что является признаком хорошего развития сети ГЭР (рис. 3, см. на вклейке).
Зона пеллюцида ооцитов не утолщена, нормальной плотности, без посторонних включений. Перивителиновое пространство нормального строения, без включений, не увеличено, без выброшенных кортикальных гранул (рис. 2, см. на вклейке). Ооциты окружены интактной, структурированной плазматической мембраной с немногочисленными выступами — микровиллиями, которые расположены группами без формирования особых соединений, вытянуты кнаружи. Присутствуют участки оолеммы, полностью лишенные микровиллий. Лизосомы в представленных клетках на ультратонких срезах не обнаружены.
Обсуждение
Настоящее исследование выявило деструктивные изменения цитоплазматических компонент: кластеризацию органелл в клетке, набухание цистерн ГЭР, исчезновение митохондрий и их вакуолизацию. Наблюдаемые ультраструктурные изменения ооцита могут отражать деструктивные процессы, связанные с начавшимся апоптозом. Активировать апоптоз могут различные метаболиты и гормоны: противовоспалительные цитокины, стероидные гормоны, окись азота и свободные радикалы, а также недостаток кислорода в тканях. Именно для апоптоза, в отличие от некроза, когда наблюдают воспалительную реакцию, характерно цитоплазматическое сжатие и уплотнение органелл [5]. Процесс программируемой клеточной гибели является каскадным и в некоторых случаях обратимым, при этом запущенные процессы апоптоза приводят к описанным изменениям в ультраструктуре клетки.
Скоординированный процесс «демонтажа» клетки путем апоптоза включает в себя обширную массу разнообразных протеаз смерти, известных как каспазы. Все каспазные белки присутствуют в нормальной здоровой клетке в состоянии инактивированных проферментов, которым необходим протеолиз для активации ферментов. Активация этих каспаз приводит к гибели клетки.
Другой большой группой регуляторов апоптоза являются продукты гена bcl-2, принадлежащие к митохондриальным белкам как активирующим (bad, bax, bak, bcl-x5), так и ингибирующим (bcl-2, bcl-w, bcl-x1) апоптоз. Выживание клетки зависит от соотношения bcl-2/bax. При низком соотношении происходит апоптоз. Это действие инициируется молекулой на мембране митохондрий цитохромом С, которая высвобождается и запускает каскад каспаз [6]. Активация каспаз носит необратимый характер, при этом предыдущие звенья процесса обратимы. Было показано, что эстрадиол и прогестерон могут модулировать экспрессию bcl-2 и bcl-хl без влияния на экспрессию проапоптотических белков bax и bak [7].
В ооците с грубозернистой деструкцией цитоплазмы, вероятно, произошел процесс запуска апоптоза, который оказался обратимым (оплодотворение наступило). Однако дальнейшее эмбриональное развитие клетки с такой патологией оказывается невозможным. После проникновения сперматозоида в ооцит происходит активация последнего. Выброс Ca2+ — самое раннее событие при активации ооцита, которое существенно для протекания кортикальной реакции, завершения мейоза и формирования пронуклеусов [8]. Более того, способность оплодотворенного ооцита развиваться до стадии бластоцисты регулируется именно амплитудой выброса Ca2+. В клетке основной органеллой, накапливающей Ca2+, служит ГЭР, поэтому изменение его внутриклеточного распределения может влиять на выброс Ca2+, оплодотворение и раннее эмбриональное развитие.
Также показано, что чрезмерные скопления гранул ГЭР обнаруживают именно в тех местах клетки, где происходят процессы деградации различных вредных веществ, метаболической дезактивации. [9]. Это служит еще одним косвенным признаком неудовлетворительных условий, в которых развивается ооцит.
Грубозернистая деструкция цитоплазмы ооцита указывает на резко сниженный потенциал дальнейшего развития. Поврежденными оказываются все органеллы клетки. ГЭР в процессе активации ооцита не обеспечивает достаточный выброс Ca2+, митохондрии не вырабатывают нужного количества АТФ для поддержания активации [6]. После проникновения сперматозоида в ооцит ядерная мембрана мужской клетки разрушается, происходит процесс удаления перинуклеарной теки с хроматина сперматозоида, в котором активное участие принимают микровиллии ооцита [10]. «Лысая» плазматическая мембрана ооцита с гранулярностью не выполняет своих функций и не способна в должной мере обеспечить распаковку мужского генома, что в итоге приводит к нарушению формирования пронуклеусов. Исчезновение микровиллий может также служить косвенным признаком схлопывания мембраны при запущенном процессе апоптоза.
Отметим, что в ооците на стадии GV гранулярность окружает ядро клетки. Можно предположить, что плохой прогноз таких ооцитов связан с повреждением цитоплазматической области около хромосомного материала. Возможно, что точка инициации гранулярности тесно связана с ядром клетки. S. Kahraman (2008) с коллегами утверждают, что причина появления ооцитов с центрально расположенной гранулярностью — хромосомные аномалии. Однако авторы изучали хромосомную патологию не ооцитов, а полученных эмбрионов. Присутствующая гранулярность ооцита возле материнского ядра может повлиять на движение пронуклеусов, их сближение и слияние, и в итоге привести к хромосомной аномалии.
Заключение
Наше исследование показало, что ооциты с грубозернистой деструкцией цитоплазмы имеют тяжелые ультраструктурные повреждения. Центрально расположенная гранулярность есть структурная дезорганизация комплексов ГЭР+митохондрии, резкое набухание цистерн ГЭР с дегенерацией митохондрий, аккумуляция комплексов во внутренней цитоплазме. Такие ооциты имеют сниженный потенциал оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона. В литературе нам не удалось найти ни одного сообщения о рождении здорового ребенка, полученного из клеток с описанной патологией.
Остается открытым вопрос влияния протокола стимуляции суперовуляции на появление ооцитов с гранулярностью. В таких случаях целесообразно предупреждать пациентов о возможном плохом исходе лечения. Вероятно, для таких женщин вариантом выбора может служить ЭКО в естественном цикле.
Изучение патологии ооцитов человека видится крайне важной задачей для повышения эффективности оплодотворения in vitro, наступления беременностей и рождения здоровых детей. Оценка качества ооцита — первый шаг в селекции эмбрионов на перенос, именно поэтому необходима дальнейшая кропотливая работа в данном направлении.
