Преэклампсия (ПЭ) – это мультисистемное гестационное осложнение, которое возникает в 2–8% беременностей и продолжает оставаться одной из ведущих причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности [1]. В настоящее время имеются доказательства в поддержку существования двух клинических фенотипов ПЭ в зависимости от дебюта заболевания: с ранним началом (до 34 недель) и поздним началом (после 34 недель) [2–4].
Ранняя ПЭ ассоциируется с высокой частотой неонатальной заболеваемости и смертности, в то время как поздняя ПЭ составляет 75–80% всех случаев ПЭ и вносит основной вклад в частоту поздних преждевременных родов, а также материнской смертности и тяжелой заболеваемости [2, 3].
Несмотря на пристальное внимание к данной проблеме, до настоящего времени не решены вопросы патогенеза, прогнозирования, поиска ранних достоверных диагностических маркеров, профилактики, а следовательно, и патогенетически обоснованного лечения. О сложности проблемы ПЭ свидетельствует и отсутствие до настоящего времени единой классификации, этиопатогенетических механизмов развития, которые могли бы объяснить мультисистемные осложнения во время беременности, риск развития эклампсии в послеродовом периоде и последствия на протяжении последующей жизни женщины.
На сегодняшний день накоплено множество данных, свидетельствующих о важной роли плаценты в развитии этого заболевания [4, 5]. В этой связи изучение жизнеспособности и функционирования клеток трофобласта плаценты представляет научный интерес в понимании механизмов развития ПЭ. Формирование плаценты начинается с прорастания ворсинок трофобласта в децидуальную оболочку матери. На апикальном конце ворсинки трофобласта образуется активно пролиферирующий участок – цитотрофобластическая колонна, часть наиболее дистально расположенных ее клеток претерпевает эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и приобретает способность к миграции и инвазии.
ЭМП – процесс потери клетками признаков эпителиальной ткани (апикально-базальной полярности, экспрессии маркеров клеточной адгезии: N- и E-кадгеринов) и приобретение признаков мезенхимальной ткани (способности к миграции и инвазии) [6]. После инициации инвазии трофобласта в децидуальную оболочку начинает формироваться пул вневорсинчатого трофобласта. Эти клетки принимают активное участие в ремоделировании спиральных артерий, благодаря чему в результате перестройки системы кровоснабжения парциальное давление кислорода в лакунах, окружающих ворсинки трофобласта, резко повышается.
На молекулярном уровне ЭМП может реализовываться путем различных сигнальных каскадов. В настоящее время особый интерес представляет Wnt-путь [7]. Доказанным фактом является то, что важную роль в развитии патологии ПЭ играет окислительный стресс. Множество работ свидетельствуют о повышении концентрации активных форм кислорода (АФК) и снижении уровня антиоксидантной защиты в периферической крови и плаценте пациенток с ПЭ [8–10]. Возможно, возникающий при ПЭ окислительный стресс способен влиять на процесс ЭМП клеток трофобласта плаценты, в связи с чем целью данной работы было определить уровень относительной экспрессии маркеров ЭМП – участников сигнального пути Wnt: N-, E-кадгеринов, Vimentin, генов SNAI1, β-катенина и GSK3beta.
Материал и методы исследования
Сбор биоматериала
В ходе выполнения работы была собрана коллекция биопсий плацентарной ткани от пациенток, родоразрешенных путем кесарева сечения по поводу тяжелой ранней/поздней ПЭ и женщин, родоразрешенных путем кесарева сечения по неакушерским показаниям (контрольная группа). Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании, все процедуры были одобрены Этическим комитетом ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени с реакцией обратной транскрипции
Выделение РНК из образцов проводилось в ExtractRNA реагенте (Евроген, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Далее следовало проведение обратной транскрипции набором MMLV-RT-kit (Евроген, Россия) по протоколу производителя. Последующая полимеразная цепная реакция в реальном времени проводилась с помощью готовой смеси 5хqPCRmixHS SYBR (Евроген, Россия). Данные обрабатывали с помощью программы QGENE (2-ΔCt метод). Нормирование экспрессии каждого гена проводилось на ген «домашнего хозяйства» β-актина (ACTB).
Вестерн-блот анализ
Для анализа уровня относительной экспрессии выбранных белков в пробах плацентарной биопсии был использован метод вестерн-блот анализа с хемилюминисцентной детекцией. Окрашивание белок-специфичными и антивидовыми антителами проводили в течение часа при комнатной температуре. Проявка мембраны осуществлялась в автоматизированном приборе ChemiDoc (Biorad, США) с последующим анализом интенсивности хемилюминисценции.
Статистический анализ
Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение среднего (ст. откл.). Статистический анализ проводили в программе Statistica 6.0 (StatSoft, USA) с использованием теста Шапиро–Вилка, однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и критерия Краскела–Уоллиса. Различие между группами считали статистически достоверным при уровне значимости p<0.05.
Результаты исследования
Клинические характеристики пациенток представлены в табл. 1. В исследование были включены 52 пациентки, разделенные на три группы: контрольная группа (n=21), женщины с ранней ПЭ (n=17) и с поздней ПЭ (n=14). Показатели систолического и диастолического давления, а также концентрация белка в моче в группе с ранней и поздней ПЭ значимо отличаются от контрольной группы. В ходе исследования от каждой пациентки была получена плацентарная биопсия, в дальнейшем проанализированная биохимическими и молекулярно-биологическими методами.
Анализ уровня относительной экспрессии белка промежуточных филаментов Vimentin, маркера мезенхимальных клеток, в ткани плаценты проводился методом вестерн-блот анализа. Результаты экспериментов не выявили значимых различий в уровне его экспрессии (рис. 1а).
E- и N-кадгерины относятся к мембранным гликопротеинам, обеспечивающим клеточную адгезию и межклеточные контакты. E-кадгерин участвует в регуляции пролиферации, узнавания и подвижности эпителиальных клеток. N-кадгерин, впервые обнаруженный на нервной ткани, также отвечает за межклеточные контакты различных типов клеток, при эмбриональном развитии наблюдается повышение его количества в мезодерме. N-кадгерин способен связываться с представителями семейства катенинов, белками участвующими в передаче сигнала от поверхности клетки к ядру, в частности и в Wnt-сигнальном пути. При исследовании этих важнейших молекул клеточной адгезии мы обнаружили, что в плацентах из групп ПЭ уровень их экспрессии схож с образцами из контрольной группы (рис. 1б). При изучении ЭМП в плаценте нам был особо интересен канонический Wnt-сигнальный путь. Его важнейшими участниками являются белки β-катенин, передающий сигнал о внеклеточном окружении от кадгеринов в ядро, и белок GSK3beta, ключевой регулятор Wnt-пути, способный фосфорилировать β-катенин [11]. Фосфорилирование β-катенина является сигналом для его последующей деградации, что означает потерю стимуляторного сигнала от кадгеринов [12]. Уровень экспрессии генов β-катенина и GSK3beta не изменялся в исследуемых группах (рис. 2a и б). Отталкиваясь от полученных данных, важно было выяснить, меняется ли экспрессия другого важного фактора ЭМП – гена SNAI1, способного связываться с промотором гена Е-кадгерина и репрессировать его транскрипцию. ПЦР-анализ не выявил значимых различий в уровне экспрессии SNAI1 (рис. 2в).
Обсуждение
ЭМП – это универсальная клеточно-тканевая программа, в результате которой эпителиальные клетки претерпевают ряд морфофункциональных изменений и приобретают мезенхимальный фенотип. Эпителиальные клетки характеризуются апикально-базальной полярностью, наличием плотных и адгезионных контактов. Мезенхимальные клетки, напротив, отличаются слабо выраженной полярностью, веретенообразной морфологией, повышенной способностью к инвазии и миграции. В ходе формирования плаценты, клетки апикальной части ворсин хориона, вступают в ЭМП, чтобы сформировать пул клеток, обладающий высоким инвазивным потенциалом. По результатам нашего исследования экспрессия N- и E-кадгеринов, важных участников ЭМП трофобласта плаценты, не меняется при ПЭ, так же как и экспрессия транскрипционного фактора SNAI1, способного супрессировать экспрессию E-кадгерина. Последовательное бифосфорилирование SNAI1 посредством белка GSK3beta приводит к деградации этого транскрипционного фактора, однако уровень экспрессии GSK3beta в исследуемых группах оказывается на том же уровне, что и в контрольной группе.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что, вероятно, Wnt-сигнальный путь не подвержен изменениям при ранней и поздней ПЭ. Возможно, в программе ЭМП клеток плаценты при ПЭ происходят сбои, но они затрагивают другие сигнальные каскады, что, безусловно, требует тщательного исследования.
Заключение
Исходя из полученных данных, можно сделать заключение, что при ПЭ не нарушен канонический Wnt-сигнальный каскад, играющий важнейшую роль при ЭМП клеток трофобласта плаценты.
