Экспрессия mir-29b в эпителии шейки при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях

Файзуллин Л.З., Карнаухов В.Н., Байрамова Г.Р., Чернова В.Ф., Мзарелуа Г.М., Чаусов А.А., Назарова Н.М., Трофимов Д.Ю.

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва
Цель исследования. Изучить уровень экспрессии mir-29b в эпителии шейки матки при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях.
Материал и методы. В исследование включены 74 женщины репродуктивного возраста, составившие 3 группы: I группа – 24 пациентки с диагнозом LSIL; II группа – 20 женщин с диагнозом HSIL; контрольная III группа – 30 женщин без патологических изменений шейки матки. Использовали цитологический, гистологический методы исследования, расширенную кольпоскопию, тестирование на вирус папилломы человека (ВПЧ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Измерение уровня экспрессии микроРНК проводили методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием комплекта реактивов TaqMan miRNA Assay (Applied Biosystems).
Результаты исследования. Выявлено снижение уровня экспрессии микроРНК mir-29b в 2,2 раза при LSIL, и в 4,2 раза при HSIL (p=0,008 и 0,0002, соответственно). Оценка экспрессии mir-29b позволяет предсказать наличие цервикальной интраэпителиальной неоплазии с чувствительностью 70% и специфичностью 72,2%. Диагностическая эффективность составила 70,3%.
Заключение. Проведенное исследование позволяет наряду с традиционными методами рассматривать mir-29b как один из информативных молекулярных маркеров прогнозирования степени поражения цервикального эпителия при неопластических заболеваниях шейки матки.

Ключевые слова

цервикальная интраэпителиальная неоплазия
LSIL
HSIL
ВПЧ
экспрессия mir-29b

Рак шейки матки является вторым после рака молочной железы наиболее частым злокачественным заболеванием у женщин репродуктивного возраста. Ежегодно более чем у полумиллиона женщин диагностируется рак шейки матки, при этом около 200 000 – с летальным исходом [1, 2]. Причины развития рака шейки матки до конца не изучены. Известно, что это многоэтапный и длительный процесс, приводящий к трансформации нормального эпителия шейки матки в цервикальную интраэпителиальную неоплазию (ЦИН) и инвазивный рак [3].

Проведенные в последние годы эпидемиологические и молекулярные исследования показали, что в подавляющем большинстве случаев ЦИН обусловлены высоко онкогенными типами вируса папилломы человека (ВПЧ). Синтез ранних вирусных онкопротеинов Е5, Е6 и Е7 способствует ингибированию клеточной дифференцировки, нарушению нормальных процессов апоптоза и пролиферации, повреждению хромосом, может инициировать гиперпластические процессы в пораженной ткани вплоть до рака шейки матки [4, 5].

В настоящее время в зарубежной литературе имеется много публикаций, в которых доказана роль микроРНК в развитии неопластической трансформации [6, 7]. МикроРНК – короткие одноцепочечные молекулы длиной 20–25 нуклеотидов, осуществляющие регуляцию экспрессии генов на посттранскрипционном уровне путем ингибирования синтеза белка с мРНК [8]. МикроРНК участвуют в регуляции большинства фундаментальных биологических процессов развития организма: делении клеток, смене фаз клеточного цикла, апоптозе, клеточной миграции и инвазии, ангиогенезе, формировании иммунного ответа. Многочисленные исследования показали, что повышение или снижение экспрессии определенных микроРНК ассоциируются с развитием предраковых и раковых процессов шейки матки [9, 10].

Особый интерес представляет микроРНК mir-29b, снижение уровня экспрессии которой выявляли при раке различной локализации. Предполагается, что mir-29b выполняет функцию супрессора опухолевого роста, регулируя процессы клеточной пролиферации, апоптоза, метастазирования и хемочувствительности [11, 12]. Значительно в меньшей степени известно о роли mir-29b при предраковых поражениях шейки матки. В связи с этим целью исследования явилось изучение уровня экспрессии mir-29b в развитии ЦИН.

Материал и методы исследования

В исследование были включены 74 женщины репродуктивного возраста (средний возраст составил 30,2±1,2 года). Пациентки были разделены на 3 группы: I группа – 24 женщины с диагнозом LSIL (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени); II группа – 20 пациенток с диагнозом HSIL (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокой степени). Контрольную III группу составили 30 условно здоровых женщин без патологических изменений шейки матки. Всем пациенткам проводилась расширенная кольпоскопия по общепринятой методике с целью выявления наиболее выраженных изменений эпителия шейки матки. Диагноз SIL (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой и высокой степени) был верифицирован на основании цитологического и гистологического исследования шейки матки. Тестирование на инфицированность ВПЧ было проведено методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием «Комплекта реагентов HPV квант-21, который предназначен для выявления, типирования и количественного определения ДНК ВПЧ низкого (6, 11, 44) и высокого (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82) канцерогенного риска» (ДНК-Технология, Россия).

Измерение уровня экспрессии микроРНК проводили методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием комплекта реактивов TaqMan miRNA Assay (Applied Biosystems).

Статистическую обработку результатов исследования уровней экспрессии mir-29b проводили методом непараметрического анализа с использованием программы Statistica 10, IBM SPSS Statistics v22. Для сопоставления двух групп по количественным признакам применяли U-критерий Манна-Уитни. Различие между группами полагали статистически значимыми при р<0,05. Для выявления точки отсечки положительных результатов диагностического теста и определения его диагностической точности использовались бинарная логистическая регрессия и ROC-кривая.

Результаты исследования

При обследовании пациенток I и II групп выявлены различные аномальные кольпоскопические картины. Наиболее частыми кольпоскопическими признаками в обеих группах были атипическая зона трансформации с ацетобелым эпителием (АБЭ), который выявлялся чаще в пределах зоны трансформации и проявлялся в виде йоднегативных участков с четкими контурами (91,7 и 95% соответственно). При этом зона трансформации I наблюдалась у 23 пациенток I и у 18 – II группы; зона транформации II – у 1 пациентки в I группе и у 2 пациенток II группы. В I-й группе АБЭ с нежной пунктацией (П) выявлен у 7 (29,2%) пациенток, АБЭ с мозайкой (М) – у 9 (37,5%), одновременно с П и М – у 7 (29,2%). Эктопия шейки матки с атипической зоной трансформации выявлена у 6 (25%) пациенток. Атипические сосуды выявлены у 4 (16,7%) женщин. Во II группе кольпоскопически выявлены более выраженные изменения в виде АБЭ с грубой пунктацией (П) – у 5 (25%) пациенток, АБЭ с грубой мозайкой (М) – у 9 (45,0%), одновременно с грубой П и М – у 4 (20,0%). Эктопия шейки матки с атипической зоной трансформации выявлена у 5 (25%) пациенток. Атипические сосуды выявлены у каждой четвертой пациентки. В одном случае в I группе и в 2 случаях во II группе мы не выявили каких-либо патологических изменений на шейке матки. Однако по данным цитологического исследования были верифицированы диагнозы LSIL (в I группе) и HSIL (во II группе), что потребовало выскабливания цервикального канала. В контрольной группе нормальная зона трансформации выявлена у всех пациенток.

По результатам тестирования на ВПЧ выявлены различные высоко онкогенные типы вируса: 16 тип – у 19 пациенток (в I группе у 7, во II – у 12), 18 тип – у 9 женщин (в I группе у 3, во II – у 6), другие типы вируса (33, 45, 52, 58) – у 16 пациенток (в I группе у 14, во II группе – у 2 пациенток). Сочетание нескольких высоко онкогенных типов ВПЧ встречалось у 5 пациенток.

Результаты исследования экспрессии mir-29b в эпителии шейки матки в норме и при разной степени выраженности ЦИН приведены в таблице. Было выявлено снижение уровня экспрессии исследуемой микроРНК в 2,2 раза при LSIL, и в 4,2 раза – при HSIL (p=0,008 и 0,0002 соответственно).

Использование логистической регрессии и ROC-анализа (рисунок) показало, что оценка экспрессии mir-29b позволяет предсказать развитие ЦИН на основании исследования mir-29b с чувствительностью 70% и специфичностью 72,2%. Диагностическая эффективность составила 70,3%.

Обсуждение

Mir-29b входит в семейство микроРНК mir-29, мишенью для которых являются гены, участвующие в регуляции клеточной пролиферации, апоптоза, дифференцировки и старении клеток. В настоящее время имеется ряд публикаций, указывающих на функцию mir-29b как супрессора злокачественных образований [11, 12]. Экспериментальные исследования показали, что mir-29b активирует апоптоз в раковых клетках путем инактивации мРНК гена Mcl-1, кодирующего антиапоптотический белок, являющийся членом семейства Bcl-2 [13]. Более того, экспрессия белка р53, индуцирующего апоптоз во многих типах раковых клеток, прямо коррелирует с уровнем mir-29b [14]. Экзогенно введенная миелоидным мышам mir-29b тормозит рост и приводит к апоптотическому разрушению раковых клеток [12]. Мишенью для mir-29b являются также прометастатические факторы, участвующие в ангиогенезе, ремоделировании коллагена, протеолизе [11].

В отличие от других типов рака, для рака шейки матки имеются четко выраженные предраковые состояния – ЦИН различной степени тяжести. Поэтому крайне важно установить как рано микроРНК, участвующие в опухолевом процессе, меняют свою экспрессию в процессе неопластической трансформации, и как они могут быть использованы для прогноза заболевания.

В настоящем исследовании мы показали, что уровень экспрессии mir-29b в эпителии шейки матки значительно снижается уже на стадии ЦИН. Проведение логистического регрессионного анализа ROC-кривой показало, что количественное измерение экспрессии mir-29b в эпителии шейки матки позволяет диагностировать неопластические поражения с чувствительностью 70% и специфичностью 72%.

Заключение

Таким образом, проведенное исследование позволяет наряду с традиционными методами, рассматривать mir-29b, как один из информативных молекулярных маркеров прогнозирования степени поражения цервикального эпителия при неопластических заболеваниях шейки матки.

Список литературы

1. Прилепская В.Н., Коган Е.А., Трофимов Д.Ю. Возможности диагностики и лечения заболеваний шейки матки. Акушерство и гинекология. 2013; 9: 90-6.

2. Siegel R., Naishadham D., Jemal A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 2013; 63(1): 11-30.

3. Waggoner S.E. Cervical cancer. Lancet. 2003; 361(9376): 2217-25. doi: 10.1016/S0140-6736(03)13778-6.

4. Scheffner M., Werness B.A., Huibregtse J.M., Levine A.J., Howley P.M. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. Cell. 1990; 63(6): 1129-36.

5. Roman A., Munger K. The papillomavirus E7 proteins. Virology. 2013; 445(1-2): 138-68.

6. Palmero E.I., de Campos S.G., Campos M., de Souza N.C., Guerreiro I.D., Carvalho A.L., Marques M.M. Mechanisms and role of microRNA deregulation in cancer onset and progression. Genet. Mol. Biol. 2011; 34(3): 363-70.

7. Stahlhut C., Slack F.J. MicroRNAs and the cancer phenotype: profiling, signatures and clinical implications. Genome Med. 2013; 5(12): 111.

8. Chua J.H., Armugam A., Jeyaseelan K. MicroRNAs: biogenesis, function and applications. Curr. Opin. Mol. Ther. 2009; 11(2): 189-99.

9. Файзуллин Л.З., Карнаухов В.Н., Мзарелуа Г.М., Чернова В.Ф. Экспрессия микроРНК при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки. Акушерство и гинекология. 2015; 9: 27-32.

10. Hayes J., Peruzzi P.P., Lawler S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol. Med. 2014; 20(8): 460-9.

11. Yan B., Guo Q., Fu F.J., Wang Z., Yin Z., Wei Y.B., Yang J.R. The role of miR-29b in cancer: regulation, function, and signaling. Onco Targets Ther. 2015; 8: 539-48.

12. Liu H., Wang B., Lin J., Zhao L. MicroRNA-29b: an emerging player in human cancer. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2014; 15(21): 9059-64.

13. Mott J.L., Kobayashi S., Bronk S.F., Gores G.J. mir-29 regulates Mcl-1 protein expression and apoptosis. Oncogene. 2007; 26(42): 6133-40.

14. Park S.Y., Lee J.H., Ha M., Nam J.W., Kim V.N. miR-29 miRNAs activate p53 by targeting p85 alpha and CDC42. Nat. Struct. Mol. Biol. 2009; 16(1): 23-9.

Поступила 25.09.2015
Принята в печать 02.10.2015

Об авторах / Для корреспонденции

Файзуллин Леонид Закиевич, к.б.н., в.н.с. лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, России, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (916) 710-67-89. E-mail: l_faizullin@oparina4.ru
Карнаухов Виталий Николаевич, м.н.с. лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, России, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (916) 710-67-89. E-mail: v_karnauhov@oparina4.ru
Байрамова Гульдана Рауфовна, д.м.н., зав. по клинической работе научно-поликлинического отделения ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, России, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (909) 994-77-00. E-mail: g_bairamova@oparina4.ru
Чернова Виктория Федоровна, аспирант ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, России, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4
Мзарелуа Гуранда Мерабовна, аспирант ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, России, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-14-03. E-mail: mzareluag@mail.ru
Чаусов Андрей Александрович, м.н.с. отделения медико-социальных исследований ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, России, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-69-48. E-mail: a_chausov@oparina4.ru
Назарова Нисо Мирзоевна, д.м.н., в.н.с. научно-поликлинического отделения ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, России, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-14-03. E-mail: n_nazarova@oparina4.ru
Трофимов Дмитрий Юрьевич, д.б.н., зав. лабораторией молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, России, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (916) 614-49-22. E-mail: d_trofimov@oparina4.ru

Для цитирования: Файзуллин Л.З., Карнаухов В.Н., Байрамова Г.Р., Чернова В.Ф., Мзарелуа Г.М., Чаусов А.А., Назарова Н.М., Трофимов Д.Ю. Экспрессия mir-29b в эпителии шейки при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях. Акушерство и гинекология. 2016; 2: 87-90.
http://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.2.87-90

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.