Дозревание ооцитов in vitro (in vitro maturation, IVM) – это альтернативная вспомогательная репродуктивная технология, подразумевающая аспирацию незрелых ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) из антральных фолликулов и их последующее созревание in vitro [1, 2].
Созревание яйцеклетки начинается с возобновления мейоза in vivo в ответ на преовуляторный всплеск лютеинизирующего гормона (ЛГ) и представляет собой процесс развития ооцита со стадии зародышевых пузырьков GV (профазы I) начала первого мейотического деления (включающего последующие стадии метафазы I, анафазы I и телофазы I) до стадии метафазы II (MII) второго мейотического деления [3]. Созревание яйцеклетки также сопровождается подготовкой цитоплазмы к оплодотворению и раннему эмбриональному развитию.
Во время процедуры классического экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) пациенткам вводят триггер овуляции для индуцирования завершения мейоза ооцитов в фолликулах, чтобы извлечь зрелые ооциты на стадии МII через 35–36 ч после инъекции. Без введения триггера овуляции большая часть аспирированных ооцитов оставалась бы на стадии GV. Незрелые ооциты стадии GV могут созревать in vitro, когда их забирают из антральных фолликулов и культивируют в специальных средах для дозревания [4].
Созревание ооцитов in vitro было впервые описано еще в 1930-е гг. [1], а сама технология IVM для человеческих ооцитов была впервые представлена Р. Эдвардсом в 1965 г. [5]. Однако на практике данная методика продемонстрировала положительные результаты только в 1990-е гг.: в 1991 г. была зарегистрирована первая беременность после IVM [6], а в 1994-м – первый случай живорождения после применения IVM у пациенток с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) [7].
Методика IVM в первую очередь актуальна именно для пациенток с СПКЯ, поскольку они очень чувствительны к стимуляции гонадотропинами и имеют высокие риски развития синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) в стандартных протоколах ЭКО [8]. Применение IVM у пациенток данной категории позволяет избежать рисков развития СГЯ за счет легкой короткой стимуляции непосредственно перед аспирацией, либо вообще без стимуляции [9]. Также для таких женщин характерно наличие большого количества антральных фолликулов и незрелых ооцитов [10]; результаты исследований позволяют думать о наличии положительной корреляции – чем большее число незрелых фолликулов удается аспирировать, тем выше частота достижения беременности при использовании IVM [11].
Однако методика IVM во многих странах до сих пор считается экспериментальной и не находит широкого рутинного применения в клинической практике. Также эффективность классических программ ЭКО по-прежнему остается более высокой по сравнению с IVM [9, 4,12].
Тем не менее методика IVM имеет множество преимуществ по сравнению с классическим ЭКО, таких как возможность избежать развития СГЯ, отсутствие необходимости использования гонадотропинов, более низкая стоимость и большее удобство для пациента [13]. Как уже было отмечено, внедрение IVM в клиническую практику имеет особое значение для пациенток с СПКЯ, а также с синдромом резистентных яичников и онкологическими заболеваниями.
Фолликулярный прайминг при IVM
В настоящее время существуют 3 метода фолликулярного прайминга перед аспирацией ооцитов для последующего IVM [14]:
1) минимальная стимуляция функции яичников низкими дозами фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в течение 3–6 дней без использования хорионического гонадотропина человека (ХГЧ);
2) однократная инъекция ХГЧ в дозировке 10 000 МЕ за 36 ч до пункции без предварительной стимуляции;
3) минимальная стимуляция функции яичников низкими дозами ФСГ в течение 3–6 дней с последующим праймингом ХГЧ в дозировке 10 000 МЕ за 36 ч до пункции.
Fadini R. et al. (2009) в своем исследовании сравнили все три метода, и наибольшую эффективность показала комбинация стимуляции ФСГ с последующим праймингом ХГЧ, в то время как только стимуляция ФСГ и только инъекция триггера ХГЧ не показали какого-либо достоверного положительного влияния на клинические исходы [15].
Результаты недавних исследований продемонстрировали относительно хорошие показатели живорождения в группах IVM при прайминге гонадотропинами [16, 17]. Тем не менее Lin Y. et al. (2020) представили данные, что применение триггера ХГЧ не улучшает показатели беременности у пациенток с СПКЯ в программах IVM [18].
Также по результатам недавнего ретроспективного когортного исследования [19] с использованием агониста гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) в качестве триггера не было выявлено достоверных различий в показателях созревания ооцитов по сравнению с ХГЧ, что дает возможность и перспективу рассматривать применение агониста ГнРГ как потенциальную альтернативу ХГЧ.
Применение метода IVM при различных заболеваниях
Дозревание ооцитов in vitro при синдроме поликистозных яичников
Как уже было отмечено, несмотря на явные преимущества, применение методики IVM у пациенток с СПКЯ ограничено меньшей эффективностью этой технологии в сравнении с классическим ЭКО. Тем не менее продолжаются исследования в этой области.
Walls M.L. et al. в 2015 г. показали сравнимую эффективность по частоте наступления беременности после переноса криоконсервированного эмбриона для IVM и ЭКО (34 и 30% соответственно), несмотря на то, что процент живорождения был выше для группы ЭКО [20]. Результаты ретроспективного исследования Ho V.N.A. et al. (2018) [17] показали частоту живорождения 31,7% после первого переноса криоконсервированного эмбриона после применения IVM с ХГЧ-праймингом.
В 2019 г. Ho V.N.A. et al. провели ретроспективное когортное исследование среди женщин с бесплодием и большим числом антральных фолликулов (≥24), в котором сравнили применение классического ЭКО и методики IVM для лечения пациенток данной категории [9]. Первая группа пациенток, в которую вошли 608 человек, проходили лечение с использованием методики IVM и получали ФСГ в дозировке 100 МЕ в течение 3 дней с последующим введением триггера овуляции ХГЧ в дозировке 10 000 МЕ. Вторая группа, состоящая из 311 женщин, проходила лечение в протоколе ЭКО с антагонистами ГнРГ и последующим введением триггера ХГЧ в дозировке 6500 МЕ. Количество полученных зрелых ооцитов, полученных эмбрионов, эмбрионов хорошего качества и криоконсервированных эмбрионов было достоверно меньше в группе IVM по сравнению с группой ЭКО, что позволяет сделать вывод о большей эффективности ЭКО по сравнению с IVM. Но в то же время частота живорождения после первого переноса была 222/608 (36,5%) в группе IVM против 127/311 (40,8%) (ОШ 0,74; ДИ 95% 0,42–1,30) в группе ЭКО. Кумулятивная частота живорождения после одного законченного цикла была 239/608 (39,3%) в группе IVM против 155/311 (49,8%) в группе ЭКО (ОШ 0,52; ДИ 95% 0,30–0,89). Также было зарегистрировано 11 случаев СГЯ (3,5%) в группе ЭКО и ни одного случая в группе IVM, что выгодно отличает методику IVM и позволяет рекомендовать ее для пациенток с повышенным риском развития СГЯ.
Mostinckx L. et al. в 2019 г. провели ретроспективное обсервационное исследование, в котором сравнили показатели акушерских и неонатальных исходов после IVM и контролируемой овариальной стимуляции (КОС) у пациенток с СПКЯ (фенотипы A, C и D) [21]. В исследование были включены данные о 164 беременностях (>20 недель) после IVM и данные о 229 беременностях после КОС. Как показали результаты, значительных различий между исследуемыми группами не было выявлено, за исключением повышенного риска артериальной гипертензии в группе IVM по сравнению со стандартным ЭКО (29/164 (17,9%) против 22/229 (9,6%) соответственно, p=0,02), однако это требует дальнейших исследований.
Mackens S. et al. в 2020 г. представили результаты ретроспективного когортного исследования [22], в котором сравнили риски ранних потерь беременности для IVM и стандартного ЭКО/ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) и показали, что в группе IVM показатели ранних потерь беременности были достоверно выше после переноса свежего эмбриона по сравнению с группой ЭКО/ИКСИ (57/122 (46,7%) против 53/305 (17,4%) соответственно, p<0,001). Но в то же время эти показатели существенно не отличались в случае переноса криоконсервированного эмбриона в данных группах (63/207 (30,4%) против 60/166 (36,1%) соответственно, p=0,24).
Таким образом, результаты недавних исследований отмечают наличие сильных сторон у методики IVM в проекции применения у женщин с СПКЯ, что в первую очередь требует дальнейшего развития и исследования самой этой технологии для повышения ее эффективности.
Дозревание ооцитов in vitro при синдроме резистентных яичников
Синдром резистентных яичников – это редкое эндокринное заболевание, обусловленное гипергонадотропным гипогонадизмом, для которого характерны нормальный женский кариотип 46, XX, наличие вторичных половых признаков, повышенные уровни ФСГ и ЛГ и нормальный уровень антимюллерова гормона (АМГ), нормальное количество антральных фолликулов [23]. Пациентки с таким диагнозом отличаются невосприимчивостью к стимуляции гонадотропинами, поэтому классические протоколы ЭКО для них оказываются неэффективными. До недавнего времени единственным подходом в лечении бесплодия у данной группы пациенток было проведение программ ЭКО с донорскими ооцитами [24].
Galvão A. et al. [25] в 2018 г. представили результаты исследования эффективности применения методики IVM у пациенток с синдромом резистентных яичников (n=9, 24 цикла IVM) и у пациенток с повторяющимися неудачными попытками ЭКО (n=19, 25 циклов IVM). В первой группе было получено в среднем 11,5±10,4 ОКК и 3,4±3,1 зрелых ооцитов. Частота живорождения составила 16,7% на начальный цикл и 33,3% на одного пациента. В то же время во второй группе пациенток в среднем было получено 10,6±9,2 ОКК и 1,3±2,1 зрелых ооцитов. Оплодотворение произошло только в 4 циклах, был получен только один эмбрион хорошего качества, и не было зарегистрировано ни одного случая живорождения. По результатам исследования были сделаны выводы о возможной эффективности IVM у пациенток с синдромом резистентных яичников и нецелесообразности применения данной методики у пациенток с блоком созревания ооцитов.
Flageole C. et al. [26] в 2019 г. представили клинический случай наступления беременности и последующего живорождения после IVM у 31-летней пациентки с синдромом резистентных яичников и большим количеством антральных фолликулов (n=19) с максимальным диаметром 18 мм на 5-й день менструального цикла, несмотря на хроническую ановуляцию. Первая программа ЭКО была проведена без стимуляции функции яичников, не было получено ни одной яйцеклетки. Во время второй программы ЭКО пациентка получала ФСГ (Менопур) с повышением дозы с 300 МЕ до 600 МЕ и 10 000 ХГЧ в качестве триггера овуляции перед пункцией. В итоге было аспирировано 6 ооцитов, из которых 4 дозрели в среде IVM и были оплодотворены. На 3-й день было получено 2 эмбриона надлежащего качества, один из которых был перенесен в полость матки.
Kornilov N.V. et al. [27] в 2021 г. сообщили о случае наступления беременности и последующего живорождения у 23-летней пациентки с синдромом резистентных яичников после IVM без стимуляции гонадотропинами и без использования ХГЧ в качестве триггера овуляции. У пациентки с большим числом антральных фолликулов (45) было аспирировано 15 незрелых ооцитов, 6 из них достигли метафазы II в среде культивирования IVM и были оплодотворены с помощью ИКСИ. Три эмбриона достигли стадии бластоцисты; затем два из них, лучшие по качеству, были подвергнуты преимплантационному генетическому тестированию на анеуплоидии, которое показало, что оба эмбриона эуплоидные. В дальнейшем был осуществлен перенос одного размороженного эмбриона, который привел к рождению здорового ребенка.
Учитывая тот факт, что синдром резистентных яичников является редким заболеванием, опыта применения методики IVM у пациенток с таким диагнозом пока очень мало, но те результаты, которые уже получены, позволяют говорить об эффективности и перспективности применения данной технологии у таких пациенток.
Дозревание ооцитов in vitro у пациенток с онкологическим заболеванием
Применение методики IVM также рассматривается, как один из перспективных методов сохранения генетического материала у женщин с онкологическими заболеваниями [28, 29].
В настоящее время также применяется новая методика сохранения фертильности у онкологических больных – созревание ооцитов, полученных из ткани яичника, in vitro (OTO-IVM). Частота дозревания ооцитов при применении данной технологии пока не очень высока; тем не менее, метод является перспективным для онкологических пациенток [30].
Первый случай беременности и живорождения после переноса криоконсервированного эмбриона, полученного в результате оплодотворения ооцитов, дозревших in vitro, у 21-летней пациентки с диагнозом «рак яичника (IIIC)» был зарегистрирован в 2014 г. [31]. В дальнейшем в мировой литературе было представлено еще несколько случаев живорождения после применения OTO-IVM [32, 33].
Также было показано, что успешное извлечение ОКК может быть осуществлено после удаления яичника во время кесарева сечения или плановой операции у пациенток с диагностированным во время беременности онкологическим заболеванием [34].
Segers I. et al. [35] в 2020 г. провели исследование, в котором показали перспективность OTO-IVM, особенно в сочетании с криоконсервацией ткани яичника (OTC).
Delattre S. et al. [36] в 2020 г. изучали комбинацию различных методов сохранения фертильности – стимуляция функции яичников, IVM и OTO-IVM. Выбор тактики лечения зависит от типа онкологического заболевания, срочности начала гонадотоксичной терапии и факторов риска развития преждевременной недостаточности яичников (возраст, вид химиотерапевтического лечения). Несмотря на то что методики OTO-IVM и OTC на данный момент кажутся многообещающими, требуются дальнейшие крупные исследования в этой области для подтверждения полученных результатов и уже имеющихся выводов.
Kirillova A. et al. [37] в 2020 г. опубликовали исследование, в котором производилась криоконсервация эуплоидных бластоцист, полученных в результате оплодотворения ооцитов, дозревших in vitro, у 30-летней пациентки с диагнозом «T1N1M0, HER2-позитивный люминальный рак молочной железы после левосторонней мастэктомии». Ультразвуковое исследование показало картину поликистозных яичников с большим количеством антральных фолликулов, равным 60. После заключения онколога был выбран метод односторонней овариэктомии для одновременного сохранения фрагментов коры и забора незрелых ооцитов из ткани яичника для их последующего созревания в пробирке. Всего было получено 33 ооцита, 12 из них были успешно оплодотворены, и в итоге образовались 3 бластоцисты. Генетическое исследование мутаций показало, что пациентка не является носителем. Предимплантационное генетическое тестирование показало, что все 3 бластоцисты являются эуплоидными и пригодными для переноса. Таким образом, результаты исследования позволяют сделать вывод о том, что ооциты ткани яичника, созревшие в пробирке, обладают потенциалом для образования эуплоидных бластоцист после ИКСИ, которые могут быть тестированы на наличие анеуплоидий и наследственных мутаций, а затем витрифицированы с целью сохранения фертильности у женщин с онкологическими заболеваниями.
На основании проанализированных данных можно заключить, что применение технологии IVM у пациенток с онкологическими заболеваниями является перспективным с точки зрения безопасности и требует дальнейших крупных исследований вопроса эффективности.
Инновационная методика c использованием двухступенчатой системы созревания in vitro с капацитацией (CAPA-IVM)
Для повышения эффективности классического IVM была разработана инновационная методика c использованием двухступенчатой системы созревания in vitro с капацитацией (CAPA-IVM). Данная система включает в себя 2 стадии: стадию pre-IVM, которая препятствует спонтанному возобновлению мейоза, сохраняет щелевые контакты в ОКК и способствует приобретению компетентности ооцитами, а также стадию IVM, которая индуцирует возобновление мейоза и созревание ооцитов. Для поддержания блока мейоза ооцитов после аспирации из антральных фолликулов, на стадии pre-IVM используется натрийуретический пептид C-типа, который является естественным фолликулярным фактором, поддерживающим блок мейоза ооцитов в профазе I мейоза (GV) в антральных фолликулах яичников до овуляции. Кроме того, натрийуретический пептид C-типа в настоящее время считается естественным ингибитором созревания ооцитов [38]. Натрийуретический пептид C-типа продуцируется клетками пристеночной гранулезы и секретируется в фолликулярную жидкость, где связывается с рецептором натрийуретического пептида 2 (NPR2), ген которого экспрессируется в клетках кумулюса, чтобы индуцировать продукцию цГМФ; цГМФ попадает в ооцит через щелевые контакты и ингибирует активность фосфодиэстеразы 3А, тем самым препятствуя деградации цАМФ и поддерживая блок мейоза в ооцитах.
Sánchez F. et al. [39] в 2017 г. представили исследование, результаты которого позволяют сделать вывод, что применение оптимизированной методики IVM, включающей подготовительный этап с натрийуретическим пептидом С-типа и дальнейшее созревание в присутствии ФСГ и амфирегулина у женщин с СПКЯ с 3-дневной стимуляцией Менопуром (225 МЕ-225 МЕ-150 МЕ) без введения триггера ХГЧ, позволяют улучшить компетентность ооцитов, полученных из маленьких (2–8 мм) антральных фолликулов. Частота созревания на ОКК повысилась до 70%, что достоверно выше, чем для стандартной методики IVM (49%; p≤0,001). Также, повысился процент ОКК, из которых были получены эмбрионы 3-го дня, пригодные к переносу/криоконсервации и бластоцисты хорошего качества (с 23 до 43%; p≤0,001 и с 8 до 18%; p≤0,01, соответственно).
Также Sánchez F. et al. [40] в 2019 г. опубликовали исследование, результаты которого показали, что использование системы CAPA-IVM привело к достоверному улучшению созревания ооцитов по сравнению со стандартным IVM (62% против 48% соответственно; p=0,034). Показатели эмбрионов хорошего качества на зрелый ооцит и на ОКК были достоверно выше для CAPA-IVM по сравнению со стандартным IVM (38% против 24%; p=0,045, 24% против 12%, p=0,018 соответственно). Также процент качественных эмбрионов 3-го дня на ОКК был достоверно выше в группе CAPA-IVM (9,1% против 3,9%, p=0,028), что привело к заметному увеличению среднего числа эмбрионов, пригодных к переносу на пациента в группе CAPA-IVM, в сравнении со стандартным IVM (4,2% против 2,2%; p=0,0002). Полученные результаты позволили утверждать, что использование методики CAPA-IVM приводит к значительным улучшениям показателей созревания ооцитов, а также эмбриологических исходов, в особенности для ооцитов, полученных из небольших антральных фолликулов.
Vuong L.N. et al. [41] в 2020 г. представили рандомизированное проспективное исследование, в котором оценивали эффективность двухступенчатой системы CAPA-IVM по сравнению со стандартной IVM у женщин с поликистозными яичниками. Результаты показали, что достоверно более высокий процент ооцитов достиг метафазы II через 30 ч после CAPA-IVM по сравнению со стандартной IVM (63,6 против 49,0 соответственно; p<0,001); количество эмбрионов хорошего качества на ОКК также было больше в группе CAPA-IVM (18,9 против 12,7; p=0,11). Частота наступления клинической беременности на перенос эмбриона была 63,2% в группе CAPA-IVM против 38,5% в группе стандартной IVM (p=0,04). Частота живорождения на перенос эмбриона статистически не отличалась для CAPA-IVM и стандартной IVM (50,0 против 33,3%; p=0,17). Не было зарегистрировано случаев пороков развития; вес детей при рождении был сопоставим для обеих групп. Результаты исследования свидетельствуют о том, что применение системы CAPA-IVM достоверно улучшило показатели созревания ооцитов и наступления клинической беременности по сравнению со стандартной IVM у пациенток с СПКЯ.
Kirillova A. et al. [42] в 2021 г. опубликовали исследование, в котором изучали потенциал развития компетентности ооцитов ткани яичника у пациенток с опухолями репродуктивной системы с использованием CAPA-IVM, в сравнении со стандартной IVM. В данное экспериментальное исследование были включены 10 пациенток со злокачественными новообразованиями органов репродуктивной системы, у которых было получено 210 ооцитов. После овариэктомии из ткани яичника извлекали незрелые ОКК, которые отдельно культивировали либо в двухступенчатой системе CAPA-IVM в течение 53 ч, либо в стандартной системе IVM в течение 48 ч. После IVM все ОКК были очищены, а зрелые ооциты либо витрифицированы (n=5), либо использованы для ИКСИ (n=5). Эмбрионы культивировали в течение 5–6 дней, а полученные бластоцисты витрифицировали. Как показали результаты, использование системы CAPA-IVM привело к большей частоте созревания ооцитов ткани яичника по сравнению со стандартной IVM (56% и 35% соответственно, р=0,0045), а также была отмечена тенденция к меньшей дегенерации после IVM. Только метод CAPA-IVM способствовал образованию бластоцист. На основании полученных результатов был сделан вывод, что применение системы CAPA-IVM улучшило компетентность ооцитов тканей яичника по сравнению со стандартной IVM, что позволяет предположить, что программы сохранения фертильности могут стать более эффективными с использованием системы IVM с капацитацией.
Заключение
На настоящий момент методика IVM хорошо изучена и имеет ограниченное применение для определенных групп пациенток, но не может составить конкуренцию классическому ЭКО, поскольку эффективность IVM остается более низкой.
Инновационная методика CAPA-IVM демонстрирует большую эффективность по сравнению со стандартным IVM и конкурентоспособность по отношению к классическому ЭКО/ИКСИ. Тем не менее данная методика еще недостаточно изучена и пока имеет ограниченное применение. На основании воодушевляющих результатов недавних исследований можно заключить, что методика CAPA-IVM имеет хорошие перспективы для развития, что требует дальнейших работ в этой области для последующего внедрения в широкую клиническую практику.
