Изучение этиопатогенеза синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) показало многофакторность его развития с вовлечением различных органов и систем, в частности гипоталамо-гипофизарного комплекса, овариальных и экстраовариальных факторов [4, 8, 18]. Многие авторы считают, что для формирования СПКЯ большое значение имеет генетическая предрасположенность, а генетическое осмысление патогенеза синдрома позволит врачам индивидуализировать тактику лечения пациентов [1, 6, 7, 11]. Отмечено, что наличие гиперандрогении у матери или сестер ассоциируется с повышенным риском развития клинических симптомов СПКЯ. В частности, в семьях описана связь между андрогенной алопецией, инсулинорезистентностью и наличием СПКЯ [7]. При наличии СПКЯ
у матери и сестер существует генетическая предрасположенность к заболеванию (в 100 и 50%
случаев соответственно) с вероятностью пенентрации в 77 и 88% случаев [11].
Однако, несмотря на уже имеющиеся работы, подтверждающие кластерное, семейное накопление при СПКЯ, генетические механизмы гиперандрогении до сих пор остаются невыясненными.
Ключевые гены, имеющие отношение к развитию клинических проявлений СПКЯ, представлены двумя основными группами: гены, контролирующие состояния гиперинсулинемии и инсулинорезистентности, и гены, отвечающие за синтез стероидных гормонов и индивидуальную чувствительность тканей к андрогенам [14].
Роль полиморфизмов генов в настоящий момент остается предметом оживленных дискуссий [3, 9,
15, 16]. Полиморфизмы генов, ассоциируемыхс синдромом, обусловливают полигенность распространенности носительства единственного аллеля у больных и здоровых людей среди популяции. Примерно у половины женщин с СПКЯ обнаружены дефекты рецептора инсулина, что
приводит к нарушению внутриклеточных сигнальных механизмов действия инсулина [17].
Вместе с тем до настоящего времени, несмотря на достаточно большие усилия, не были определены достоверные молекулярно-генетические дефиниции, которые бы объединяли пациентов
с СПКЯ. Современный уровень науки, появление высоких технологий и достижения молекулярно-генетических исследований, естественно, предрасполагают к новому этапу в попытках
детерминировать клинические признаки СПКЯ на молекулярно-генетическом уровне.
Целью нашего исследования явился поиск молекулярно-генетических факторов, участвующих в формировании эндокринно-метаболических нарушений при СПКЯ, которые могут способствовать уточнению патогенетических механизмов развития заболевания.
Материал и методы исследования
Мы обследовали 160 пациенток, обратившихся в отделение сохранения и восстановления репродуктивной функции Центра в 2007–2009 гг. В основную группу вошли 98 женщин с диагнозом СПКЯ, верифицированным согласно критериям Роттердамского соглашения 2003 г. Средний возраст составил 27,7±4,2 года.
В группу сравнения (без СПКЯ) были включены 62 пациентки с трубно-перитонеальным и мужским факторами бесплодия. Средний возраст составил 28,4±3,2 года.
Молекулярно-генетические методики включали в себя полимеразную цепную реакцию (ПЦР), реакцию мини-секвенирования, агарозный гель-электрофорез, масс-спектрометрию. В ходе исследования были проанализированы полиморфизмы генов SGTA, FST, IRS1, IRS2, PPARg, HSD17B5, HSD17B6, FTO, FEM1B, FEM1A.
Исследования проводились пациенткам обеих групп в Научно-исследовательском институте
физико-химической медицины с последующей статистической обработкой полученных результатов.
Для проведения исследования у пациенток с СПКЯ и пациенток группы сравнения была взята венозная кровь в объеме 5 мл из кубитальной вены. Свежезамороженные при -20 °C образцы передавали в лабораторию для выполнения генетического исследования. ДНК выделяли с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) по протоколу производителя, а также посредством фенолхлороформного метода. Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси, содержащей
66 мМ трис-HCl, рН 9,0, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgCl2, по 100 мкМ каждого дНТФ, 1 ед. Tag-полимеразы (5 u/μl) и по 5 пмоль каждого праймера в объеме 10 мкл. Реакцию осуществляли при едином температурном профиле: 95 °С ‒ 2 мин, 95°С ‒ 30 с, 60 °С – 2 мин, 72 °С ‒ 3 мин, 37 циклов. Последовательности праймеров подбирали с использованием программных пакетов Vector NTI 9 и Primer Express 2.0. Специфичность подобранных вариантов проверяли с помощью онлайн-ресурса http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Для удаления из смеси всех незадействованных дезоксинуклеотидтрифосфатов проводили реакцию дефосфорилирования. Для этого к смеси
добавляли 5 мкл раствора, содержащего 1 ед. щелочной фосфатазы [Shrimp Alkaline Phosphatase
(Fermentas, Литва)] и 0,5 мкл буфера, использованного ранее. Реакцию проводили по программе: 37°С – 30 мин, 85°С – 10 мин. Для анализа полиморфизмов генов использовали метод масс-спектрометрического мини-секвенирования. Данный метод представляет комбинацию мини-секвенирования и масс-спектрометрического анализа продуктов реакции мини-секвенирования на времяпролетном MALDI спектрометре (MALDI-TOF масс-спектрометрия). Для осуществления реакции мини-секвенирования использовали синтетические однонуклеотидные зонды, комплементарные последовательности, непосредственно прилегающие к точке мутации. В ходе ферментативной реакции зонд достраивается на 1–2 нуклеотида, вариабельных в исследуемой области. Задачей последующего этапа явился анализ вариантов достроенного зонда, на основании которого и делался вывод о наличии того или иного генетического варианта мутации в исходной последовательности. Спектры, получаемые в ходе масс-спектрометрического исследования, интерпретировали с помощью программного обеспечения flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11) (Bruker Daltonics, Германия).
Статистические различия оценивали с использованием критерия ¢2 для таблицы сопряженности признаков 3×2. Наблюдаемые частоты встречаемости генотипов исследованного локуса проверяли на отклонение от равновесия Харди–Вайнберга по критериям c2 и G-статистики с помощью программы RxC (RowsxColumns).
Сравнение распределения частот встречаемости аллелей и генотипов в различных группах обследованных проводили с использованием точного критерия Фишера, для определения достоверности возрастных различий в парных группах применяли t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при <0,05.
Результаты исследования и обсуждение
В нашем предыдущем исследовании [5], посвященном сравнительному анализу эндокринных и метаболических характеристик пациенток с СПКЯ и без него, основанном на использовании общепринятых рутинных лабораторных тестов, нам не удалось продемонстрировать прямых ассоциаций СПКЯ с метаболическими нарушениями. Такие характеристики, как повышенный индекс массы тела (ИМТ) и ожирение I степени, нарушение толерантности к глюкозе, инсулинорезистентность, дислипидемия, были присущи пациенткам обеих групп в равной степени. Нарушения углеводного и липидного обмена в подавляющем большинстве случаев имели место среди женщин с повышенным ИМТ
и ожирением, как в основной группе, так и в группе сравнения.
Таким образом, проведенный анализ не позволил нам определить патогномоничные для СПКЯ
признаки метаболического синдрома. Вместе с тем мы обследовали взрослых женщин с уже сформированным симптомокомплексом СПКЯ. Вопросы же раннего выявления предрасположенности к развитию этого заболевания и соответственно своевременной и адекватной коррекции состояния пациентки являются приоритетными. В этой связи перспективной является попытка выявить какие-либо генетические маркеры, предрасполагающие к развитию как самого СПКЯ, так и клинических симптомов этого заболевания.
Нами была предпринята попытка найти ассоциативные связи между группой полиморфизмов генов и СПКЯ, а также были исследованы взаимосвязи и определены риски групп полиморфизмов генов с различными эндокринно-метаболическими симптомами, присущими этому заболеванию.
Приступая к молекулярно-генетическому этапу работы, мы ориентировались на исследования ведущих специалистов и публикации зарубежной печати. За рубежом изучению генетической этиологии СПКЯ уделяется большое внимание. В работах многих независимых исследователей резюмируется, что полиморфные маркеры CYP17, AR, IGF-1, VNTR INS, PPARy, TNF, IL-6 ассоциированы с развитием СПКЯ [2, 3, 9, 15, 16].
Для исследования были отобраны гены, полиморфизмы которых потенциально могут быть ответственны за возникновение как СПКЯ, так и эндокринно-метаболических нарушений (см. таблицу).
Таблица. Гены, ассоциированные с СПКЯ и эндокринно-метаболическими нарушениями (по данным литературы).
Затем мы сформировали признаки, которые в той или иной степени ассоциированы с СПКЯ и эндокринно-метаболическими нарушениями:
• ассоциации развития СПКЯ с анализируемыми полиморфизмами генов;
• ассоциации нарушения толерантности к глюкозе и изменений значения индекса НОМА у паци-
енток с СПКЯ и без СПКЯ с анализируемыми полиморфизмами генов.
Среди всех проанализированных ассоциаций полиморфизмов генов были определены значимые. Все данные были проанализированы на уровне значимости не более 0,05. Для достоверных различий были определены относительные риски (OR). При значении относительного риска выше или равном 1 носительство данного полиморфизма считалось вариантом риска, соответственно при значениях относительного риска ниже 1 данный полиморфизм определялся как протективный по отношению к анализируемому признаку. Значимые ассоциации, выявленные в ходе исследования, представлены ниже.
Для полиморфизма гена IRS2 была определена значимая ассоциация с риском развития СПКЯ, а также с риском развития метаболических нарушений на фоне СПКЯ, таких как инсулинорезистентность и нарушение толерантности к глюкозе. При носительстве минорного аллеля Т в гетерозиготном состоянии повышался риск развитии СПКЯ в 3 раза [OR (отношение шансов) = 2,908; CI (доступный интервал) = [1,246–6,787], p=0,01], при носительстве гомозиготного генотипа ТТ у женщин риск развитии СПКЯ повышалсяв 10 раз (OR=10,286; CI=[1,148–92,185], p=0,01). Минорный аллель Т показал наличие трендового риска в отношении развития нарушения толерантности к глюкозе (OR=1,02; CI= [1,048–2,269], p=0,03) при СПКЯ. При носительстве минорного аллеля Т определен двукратный риск увеличения значений индекса НОМА (OR=2,115; CI= [1,048–4,269], p=0,03).
Другие авторы также показали влияние субстрата рецептора инсулина на развитие сахарного диабета (СД) 2-го типа у женщин с СПКЯ в анамнезе [10]. Исследование проводилось на чилийской популяции. Ученые обнаружили изменение степени фосфорилирования IRS-1 Gly972Arg и IRS-2 Gly1057Asp и уменьшение клеточного ответа на инсулин. Исследования на мышах продемонстрировали, что животные, лишенные гена IRS-1, проявляют резистентность к инсулину и сниженную толерантность при нагрузке глюкозой. Это указывает на то, что повреждения гена IRS-1 могут быть причиной развития СД 2-го типа у женщин с СПКЯ [3, 9, 15, 16], что согласовывалось и с нашими результатами, полученными на популяции российских женщин.
Для полиморфизма гена IRS1 была установлена значимая ассоциация с риском развития СПКЯ, а также с риском развития на фоне СПКЯ метаболических нарушений. Однако для гомозиготного генотипа СС эффект оказался обратным, т.е. генотип СС является протективным в отношении риска развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне СПКЯ (OR=2,115; CI=[1,048–4,269], p=0,03487). При носительстве гомозиготного генотипа ТТ определяется пятикратный риск увеличения значений индекса НОМА (OR=5,885; CI=[1,082–32,014], p=0,02856).
Для полиморфизма гена HSD17B6 при носительстве минорного аллеля А был установлен трехкратный риск увеличения значений индекса НОМА (OR=2,554; CI=[1,091–5,977], p=0,02835), а носительство гомозиготного генотипа GG ассоциировалось с протективным эффектом в отношении того же признака. Для полиморфизма гена HSD17B5 был определен двукратный риск увеличения значений индекса НОМА при носительстве минорного аллеля А (OR=0,060; CI=[0,003–1,222], p=0,01835). Для полиморфизмов генов HSD17B6 и HSD17B5 ассоциаций с риском развития СПКЯ нами не выявлено, хотя американским ученым удалось выявить наличие риска возникновения СПКЯ при носительстве rs2277339, rs10459246 полиморфизма гена HSD17B5 [13].
Суммирование полученных значимых данных отчетливо продемонстрировало, что наибольшее количество взаимосвязей полиморфизмов генов с изучаемыми признаками определено для генов
IRS2 и IRS1. Однако для некоторых полиморфизмов найдены протективные эффекты в отношении
изучаемых признаков. Следует еще раз подчеркнуть, что данные ассоциации выявлены у женщин с СПКЯ и не обнаружены ни у одной пациентки группы сравнения, что еще раз указывает на патогномоничность выявленных ассоциаций именно для СПКЯ.
При исследовании остальных изучаемых полиморфизмов генов (FST, FTO, FEM1A, FEM1B, PPARg, SGTA) значимых ассоциаций не выявлено ни в группе с СПКЯ, ни в группе сравнения.
Таким образом, молекулярно-генетическое исследование позволило нам выявить ассоциации полиморфизмов генов с риском развития как СПКЯ непосредственно, так и его клинических симптомов, способных в дальнейшем приводить к нарушениям соматического состояния женщины, а также своевременно определить степень риска развития СПКЯ и его клинических симптомов у девочек в пубертатном периоде [12], имеющих отягощенный наследственный анамнез и клинические проявления эндокринно-метаболических нарушений.
