Преэклампсия (ПЭ) – мультисистемное патологическое состояние, возникающее во второй половине беременности (после 20-й недели), характеризующееся артериальной гипертензией в сочетании с протеинурией (≥0,3 г/л в суточной моче), нередко отеками и проявлениями гетерогенной полиорганной/полисистемной дисфункции/недостаточности. ПЭ возникает в 2–8% беременностей и остается ведущей причиной материнской и перинатальной смертности и заболеваемости [1, 2]. В научных работах последних десятилетий приводятся доказательства в поддержку гипотезы о существовании двух фенотипов ПЭ в зависимости от дебюта заболевания: с ранним (до 34 недель) и поздним началом (после 34 недель) [2–5]. Последние научные обзоры, основанные на убедительных исследованиях, подтверждают необходимость рассмотрения ПЭ не как единого осложнения беременности, но доказывают необходимость разделения на раннюю и позднюю и даже рассматривают возможность данного мультисистемного расстройства вне связи с гестационным процессом [6–8].
Ранняя ПЭ – наиболее тяжелый клинический вариант течения заболевания, встречается в 5–20% случаев всех ПЭ, ассоциируется с задержкой роста плода, патологическим плодово-маточным кровотоком по данным ультразвуковой допплерометрии, малым размером плаценты к моменту родов, более высокой частотой индуцированных преждевременных родов, неонатальной заболеваемости и смертности [9]. Развитие ранней ПЭ связано с нарушением инвазии трофобласта, незавершенной трансформацией спиральных маточных артерий, дезадаптацией иммунной системы, повышением уровня маркеров эндотелиальной дисфункции [10, 11].
Поздняя ПЭ составляет 75–80% всех случаев ПЭ, связана с материнской заболеваемостью (метаболическим синдромом, нарушением толерантности к глюкозе, ожирением, дислипидемией, хронической артериальной гипертензией) и ассоциирована с нормальным кровотоком при допплерометрии маточных артерий, нормальной массой тела новорожденного при рождении, нормальным объемом плаценты [5, 9].
Отдаленный прогноз женщин, перенесших ПЭ, характеризуется повышенной частотой развития ожирения, сахарного диабета, ишемической болезни сердца, инсультов. Дети этих матерей также страдают различными метаболическими, гормональными, сердечно-сосудистыми заболеваниями [12].
В настоящее время огромный интерес представляют вопросы прогнозирования и ранней диагностики ПЭ, решение которых будет направлено на предотвращение тяжелых форм [3]. В этом отношении внимание исследователей привлекают вопросы становления ранней беременности, в частности роли трофобласта и плаценты, разнообразные механизмы, в конечном счете приводящие к гипоксии и ишемии, которые сопровождаются продукцией медиаторов, повреждающих материнский эндотелий [13].
Многочисленными исследованиями показано, что поиск уникальных специфических молекулярных предикторов ПЭ на преконцепционном этапе является спорной задачей. При этом, учитывая гетерогенность этой патологии, исследователи справедливо считают, что поиски единого предиктора не оправданы, акценты должны быть смещены на ранние сроки беременности с применением «системных подходов» и направленных на разработку тест-систем для ранней диагностики, прогнозирования и в последующем персонифицированных методов лечения ПЭ, поскольку существующие лечебные подходы являются субоптимальными. Примером такого системного подхода являются протеомные исследования маркеров ПЭ, представляющие собой комплексный анализ тысяч белков и пептидов. Повышение концентрации в крови при ПЭ обнаружено для SERPINA1, α2-HS-гликопротеина (AHSG), α1-микроглобулина (AMBP), кластерина, β-цепи компонента коплемента C8, фактора комплемента Н, фибронектина; концентрация α-цепи C4b-связывающего белка и ретинол-связывающего белка 4 (RBP4), наоборот, снижена [2, 13].
AHSG и RBP4 вовлечены в метаболизм липидов и изменение их содержания в крови свидетельствует о тесной взаимосвязи нарушений в метаболизме липидов с развитием ПЭ [14].
Многообещающим объектом для протеомных исследований в области ПЭ является моча. Почечная патология рассматривается как один из критериев этого патологического состояния, а также было доказано, что уровень антиангиогенных пептидов при ПЭ изменяется как в сыворотке, так и в моче [15, 16]. Стоит отметить перспективность выбора мочи как объекта исследования, так как для рутинного анализа удобен неинвазивный забор образца, а также его стабильность при -20˚С и возможность хранения до нескольких лет при -70˚С без предварительной подготовки. Исследование протеома мочи показало, что панель белков, представленная α-цепью фибриногена, α-цепью коллагена и уромодулина, является предикторной для ПЭ при сроке беременности 28 недель [1].
Стратегия исследования/анализа эндогенных пептидов в физиологических жидкостях (плазмы, сыворотки, мочи и др.) успешно применяется для поиска биомаркеров различных заболеваний [7–10], однако исследования изменений пептидома при ПЭ единичны [5, 13]. В исследовании пептидома мочи при ПЭ достигнуты некоторые результаты: в качестве потенциальных биомаркеров называют фрагменты альбумина и SERPINA-1 [16], а также ряд фрагментов фибриногена, α1-антитрипсина, аполипопротеина L1 и других белков [13]. В недавно проведенном исследовании были идентифицированы пептидные маркеры ПЭ и в сыворотке крови [11]. Однако исследовательский интерес представляет последовательный процесс поиска предикторов ПЭ, разработки методов мониторинга течения заболевания, дифференцирования ранней поздней ПЭ, а также последующих подходов к персонифицированной медицине.
Цель исследования: определение возможности диагностики ПЭ по пептидному профилю мочи.
Материал и методы исследования
Для выявления кандидатных пептидных биомаркеров ПЭ нами было проведено исследование случай-контроль у женщин с подтвержденной умеренной и тяжелой ПЭ. Было исследовано по 8 образцов мочи женщин с умеренной и тяжелой ПЭ и контрольной группы с физиологически нормально протекающей беременностью.
Образцы мочи пациенток были получены в ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Предварительно процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ ИМБП РАН и ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова. Критериями включения для всех участников исследования были: возраст от 18 до 40 лет, одноплодная спонтанная беременность с клинической манифестацией ПЭ, информированное согласие на участие в исследовании, отсутствие тяжелой экстрагенитальной патологии, включая сахарный диабет, заболевания почек и сердечно-сосудистые заболевания. В контрольную группу были включены пациентки с физиологически нормально протекающей беременностью и общим содержанием белка в моче не выше 100 мкг/мл. Тяжесть ПЭ оценивалась согласно Федеральным Рекомендациям, утвержденным МЗ России (Методическое письмо, сентябрь, 2013).
Сбор мочи проводился в условиях стационара, с помощью катетера собиралась вторая утренняя проба мочи (средняя струя). Через 20 минут образец центрифугировался 10 минут при 2000g, 4°С. Супернатант хранился при -80°С.
1,5 мл мочи смешивали в денатурирующем буфере (4М мочевина, 20мM гидроксид аммония, 0,2% додецилсульфат натрия) и наносили на фильтры Vivaspin-4 MWCO 10 kDa (Sartorious), центрифугировали при 4000 g 20 мин. Колонки PD-10 (GE Healthcare) уравновешивали 0,01% гидроксида аммония (25 мл на колонку). 2,5 мл фильтрата наносили на колонку. Элюировали 0,01% гидроксидом аммония. 2 мл элюата лиофилизовали и растворяли в 100 мкл деионизованной воды.
Обессоленную пептидную фракцию мочи анализировали сначала на масс-спектрометре MALDI-TOF, а затем на нанопоточном хроматографе Dionex 3000 (США) с времяпролетным масс-спектрометром Maxis (Bruker, Бремен, Германия). Объем вводимой на колонку пробы составлял 1 мкл образца, использовалась колонка 75 мкм×12 см с фазой Reprosil-PurBasic C18, 3 мкм (Dr.Maisch HPLC GmbH, Аммербух-Энтринген, Германия). Проводилась градиентная хроматография с линейным увеличением относительного содержания растворителя B (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле) в потоке А (0,1% муравьиная кислоты в воде) от 3 до 50% за 40 минут.
Список из точных масс пептидов и масс их фрагментов использовался для поиска и идентификации белков по базе данных при помощи программы Mascot (MatrixScience, version 2.0.04) по базе данных IPI-human (version 3.82). Для идентификации пептидов использовались следующие параметры поиска: точность масс для родительского иона – 5 ppm; точность масс для MS/MS фрагментов – 0,50 Da; модификации – окисление метионина и пролина. Считалось, что пептид идентифицирован достоверно при score>30. Полуколичественные результаты для каждого идентифицированного по базе данных IPI_human в образце белка были получены методом label-free c выравниванием хроматограмм по времени выхода пептидов и нормировки на суммарную интенсивность в программе MaxQuant (version 1.2.2.5). Статистическая обработка протеомных результатов проводилась с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни (поиск достоверных отличий), проводился факторный анализ методом главных компонент (PCA) и иерархическая кластеризация на основе евклидовых расстояний в среде R. Достоверно отличающиеся по критерию критерия Манна–Уитни (p<0,05) пептиды были использованы для обогащения генных онтологий (GO).
Результаты исследования и обсуждение
Статистический анализ клинических данных
Средний возраст женщин с умеренной ПЭ составил 28,75±5,6 года, в группе с тяжелой ПЭ – 32,33±6,36 года, в контрольной группе – 27,53±6,67 года. Одна их женщин в группе с тяжелой ПЭ перенесла ПЭ в анамнезе. Количество первобеременных было одинаковым в обеих группах и составило 62,5%. Индекс массы тела был равен 31,4±7,8 в группе с умеренной ПЭ, 31,7±6,8 в группе с тяжелой ПЭ, в контрольной группе – 29,75±6,72.
Манифестация ПЭ в группе с умеренной формой была значительно позже, чем в группе с тяжелой ПЭ: повышение артериального давления в группе с умеренной ПЭ – с 34±6 нед, а в группе с тяжелой ПЭ – с 28±8 нед, появление протеинурии в 37±2 нед и 33±6 нед соответственно. При этом срок родов в группе с умеренной ПЭ составил 38±6 нед, а в группе с тяжелой ПЭ – 33,5±5,5 нед.
Интересно, что оперативный метод родоразрешения в группе с умеренной ПЭ был в 75%, при этом лишь в 50% случаев показанием для оперативного родоразрешения было нарастание тяжести ПЭ. В группе с тяжелой ПЭ в 100% случаев имело место оперативное родоразрешение, где показанием являлась непосредственно тяжелая ПЭ, а именно – нестабильная гемодинамика на фоне проводимой терапии, наличие неврологической симптоматики или ухудшение состояния плода.
В группе с умеренной ПЭ средняя масса новорожденного составила 3070±605 г, при этом дети рождались здоровыми или в асфиксии легкой степени. В группе с тяжелой ПЭ средняя масса плода – 2393±904 г, при этом здоровые дети были рождены лишь в 25% случаев. В контрольной группе средняя масса новорожденных составила 3325±503 г, все дети рождались здоровыми. Основные проблемы с выхаживанием детей связаны с недоношенностью, малым весом к сроку гестации и развитием респираторного дистресс-синдрома.
Результаты ВЭЖХ-МС/МС анализа пептидной фракции мочи
Стандартной методикой поиска пептидный биомаркеров долгое время являлся капиллярный электрофорез с масс-спектрометрией (КЭ-МС/MS), в то время как высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемом масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) использовалась только для идентификации последовательностей найденных пептидов. Сравнение этих двух подходов на примере образца мочи здорового человека показало, что 50% найденных пептидов идентифицируются исключительно с помощью ВЭЖХ-МС/МС, 20% – КЭ-МС/МС и 30% обеими техниками [6]. Принимая во внимание выводы, сделанные зарубежными коллегами, для изучения образцов мочи женщин, страдающих ПЭ, мы остановили свой выбор на методе ВЭЖХ-МС/МС как наиболее информативном.
В среднем, в отдельном образце мочи пациенток идентифицировалось 165±55 пептидов в группе контроля, 130±33 в группе с умеренной ПЭ и 188±31 в группе с тяжелой ПЭ (score>30) со средней массой 1527±415 Да. Из 706 пептидов обнаруженных в моче пациенток 107 пептидов встречаются во всех образцах, 137 – уникальны для умеренной формы ПЭ, 173 – встречаются лишь в моче пациенток с тяжелой формой ПЭ (рис. 1). При этом 138 пептидов мочи присутствуют только в контрольных образцах (физиологически нормально протекающая беременность).
Одной из первых попыток поиска маркеров ПЭ в петитом мочи была работа группы I. Buhimschi (2008), выполненная методом SELDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с использованием чипов). В результате была предложена панель из 5 маркеры пептидов – фрагментов двух белков – альбуцида и SERPINA-1 [16]. C-концевой фрагмент SERPINA-1 (MIEQNTKSPIFMGKVVNPTQK) мы обнаружили в образцах мочи как здоровых женщин, так и пациенток с ПЭ. N-концевой фрагмент (EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPT) мы не обнаружили, однако выявили несколько близких пептидов, они характерны для ПЭ и не встречаются в контроле. Интересно отметить, что фрагменты альбуцида также не обнаружены нами в моче здоровых беременных женщин, однако мы идентифицировали большое количество пептидов альбуцида при умеренной и тяжелой ПЭ, в том числе и маркерный пептид, предлагаемый группой I. Buhimschi (DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL).
По результатам исследования петитам сыворотки крови пациенток с ПЭ группы Qiaojun Wen [16] была предложена панель из 19 пептидов, принадлежащих 6 белкам (13 фрагментов α-цепи фибриноген I типа, 1 фрагмент SERPINA-1, 1 пептид аполипопротеина 1, 1 фрагмент ITIH4, 2 – кининогена-1, 1 – тимозина-B4).
Значимость некоторых из них для диагностики ПЭ была подтверждена нами при исследовании петитам мочи. Так, среди маркеры пептидов присутствует фрагмент N-концевого участка SERPINA-1 – EDPQGDAAQKTDT, который обсуждался выше в связи с работой I.A. Buhimschi и сова. (2008) [5]. В качестве маркеры в работе Q. Wen и сова. (2013) [11] предлагается также большая группа пептидов фибриноген А. Фрагменты С-концевого участка (с 420 по 439 аминокислотные остатки) идентифицированы нами в моче, причем часть этих фрагментов присутствует как в контроле, так и в моче пациенток с ПЭ. Фрагменты N-концевого участка (с 20 по 34 аминокислотные остатки) более специфичны: пептиды SGEGDFIAEGGGVR и ADSGEGDFIAEGGGVR есть в моче только при тяжелой ПЭ, однако в моче выявляются лишь в единичных случаях.
Группой H. Mischak, одного из ключевых исследователей петитам мочи в мире, предлагается 50 протонных маркеров ПЭ [1], однако только 13 из них идентифицированы (есть сиквенс и указана принадлежность к определенным белкам). По нашим данным из этих 13 пептидов стабильно выявляются 7 (фрагменты фибриноген, уромодулина и 4 из 8 пептидов коллагена), причем в образцах всех групп, что ставит под сомнение их диагностическую значимость как маркеров ПЭ.
Биоинформационный анализ
Для оценки возможности идентификации ПЭ по пептидному профилю мочи проводился кластерный анализ полученных данных (рис. 2). Можно отметить, что на плоскости двух главных компонент образцы из различных групп (тяжелая, умеренная ПЭ и контроль) разделяются на 3 кластера. Для повышения степени кластеризация был проведен поиск пептидов, изменение представленности которых в моче достоверно ассоциировано с принадлежностью к определенной группе. В качестве теста использовался непараметрический критерий Манна–Уитни, p-value<0,05, для каждой пары групп (контроль – тяжелая ПЭ, тяжелая ПЭ – умеренная ПЭ и контроль – умеренная ПЭ). В результате такого пожарного сравнения получены 3 группы пептидов (таблица), каждая из которых с высокой степенью разделяет соответствующие группы образцов. Отметим, что в таблицу включены только пептиды, которые встречаются не менее чем в 5 образцах.
Для данных 22 пептидов мочи повторно проведен анализ главных компонент (рис. 3). При этом объяснения вариабельность повысилась и составила 31%. Пептиды, с высокой степенью достоверности выделяющие группу ПЭ от группы с физиологически нормально протекающей беременностью (таблица), являются в основном фрагментами α-цепи коллагена I и III типов (11 из 22 пептидов) и α-цепи фибриноген I типа. Из этой группы можно выделить подгруппу из 6 пептидов – фрагментов α-цепи фибриноген и галогенов (I и III типов), а также уромодулина, позволяющих со 100% диагностической значимостью определять развитие тяжелой ПЭ. Поиск по онтология (GO анализ) для этих белков позволяет заключить, что наибольшим изменениям при тяжелой форме ПЭ подвержены процессы организации межклеточного матроска (в частности, сборка коллагеновый фибрилла), коагуляции (активация тромбоцитов), гемостаз, ответа на стресс, метаболизма коллагена, гуморальный регуляции.
Заключение
Результаты нашего исследования позволяют утверждать, что анализ эндогенных пептидов мочи беременных женщин может быть использован для диагностики и прогнозирования таких тяжелых состояний, как ПЭ. Сравнение обнаруженных в моче пептидный маркеров ПЭ с ранее опубликованными результатами других групп продемонстрировали высокий уровень совпадения. Кроме того, предложены новые ранее не известные маркеры тяжелой формы ПЭ. Верификация этих пептидов требует дальнейших исследований на большей выборке и включения дополнительных групп сравнения для оценки специфичности панели пептидов.
