Задержка роста плода (ЗРП), являющаяся одной из ведущих причин перинатальной заболеваемости и смертности в развитых странах, связана с нарушением васкуляризации плаценты [1]. На сегодняшний день не существует эффективных методов лечения ЗРП, и ключевым вопросом для предотвращения неблагоприятного перинатального исхода является необходимость своевременного родоразрешения у данной группы пациентов [2].
Антенатальное ультразвуковое наблюдение является основным диагностическим инструментом ЗРП путем мониторинга роста плода и оценки его функционального состояния посредством допплерометрии [3].
Хорошо охарактеризованные экспериментальные животные модели ЗРП имеют большое значение для более глубокого понимания патогенеза ЗРП и разработки новых терапевтических стратегий, направленных на коррекцию данного состояния [4]. Одним из самых удобных животных для моделирования ЗРП является кролик (Оryctolagus cuniculus), который обладает высоким репродуктивным потенциалом с коротким сроком беременности (30 дней) [5]. Больший размер кроликов, по сравнению с лабораторными грызунами, облегчает применение инструментальных методов диагностики, таких как ультразвуковая визуализация, которая позволяет получить точные и объективные сведения о размере плода и его гемодинамических характеристиках [6]. Другой важной особенностью является схожесть метаболических потребностей [7] и скорости активации эмбрионального генома [8] на ранних стадиях развития между эмбрионом человека и кролика. Плацента кроликов Оryctolagus cuniculus имеет гемохориальное строение и больше сходства с плацентой человека, нежели других животных [9].
Существуют различные модели формирования ЗРП у кроликов, основанные на ограничении питания матери, хирургической абляции/лигировании маточного кровотока или окклюзии пуповины; однако очевидно, что ни одна модель не воспроизводит полностью патогенез ЗРП в связи с многофакторностью его причин [4, 10]. Согласно обзору литературы, часть исследований продемонстрировала успешность применения ультразвукового исследования (УЗИ) в качестве дополнительного инструмента оценки роста и состояния плода на животных моделях, а следовательно, его применение при моделировании ЗРП представляет особый интерес [9–12].
Основной целью работы являлась оценка эффективности экспериментальной модели ЗРП на внутриутробном этапе с использованием ультразвукового отслеживания параметров фетометрии и допплерометрии Оryctolagus cuniculus.
Материалы и методы
В качестве экспериментального животного были выбраны Оryctolagus cuniculus, полученные из питомника «Стезар», с наличием прививок и сертификатов здоровья. В исследование были включены 16 самок кроликов, которые содержались индивидуально. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом (протокол № 121 от 05.12.2022) и проводилось в соответствии с Международными руководящими принципами биомедицинских исследований с участием животных, обнародованными Обществом изучения репродукции [7] и Европейской конвенцией об экспериментах на животных. Далее 16 самок были разделены на 2 группы: 1) 8 особей для создания модели ранней ЗРП; 2) 8 особей для создания поздней ЗРП. Для создания экспериментальной модели проводили перевязку сосудов правого рога матки; плоды, формирующиеся в левом роге (где перевязка сосудов не проводилась), вошли в контрольную группу. Таким образом, на одной самке кролика воспроизводилась как модель ЗРП, так и модель «условно здоровой» беременности (рис. 1). Самкам кроликов из группы поздней ЗРП перевязка сосудов проводилась на 25-й день гестации. В момент первой ультразвуковой оценки (20-й день гестации) плоды от данных самок представляли собой группу «чистого» контроля (группа III), т.к. на данном этапе беременность развивалась без вмешательств. При проведении УЗИ на 27-й день гестации данная группа представляла собой модель формирования поздней ЗРП (группа IV и V).
Для ультразвуковой оценки были сформированы следующие группы сравнения.
Группа I – экспериментальная группа ранней ЗРП (плоды из правого рога, где проводилась перевязка сосудов до наступления беременности).
Группа II – контрольная группа ранней ЗРП (плоды из левого рога, где перевязка сосудов не проводилась).
Группа III – группа «чистого» контроля (плоды от самок, которым не проводилась перевязка сосудов).
Группа IV – экспериментальная группа поздней ЗРП (плоды из правого рога, где проводилась перевязка сосудов на 25-й день гестации).
Группа V – контрольная группа поздней ЗРП (плоды из левого рога, где перевязка сосудов не проводилась).
Эксперимент (описание операции)
1) Моделирование ЗРП проводилось хирургическим методом. Для моделирования ранней ЗРП наложение лигатур на маточные сосуды проводилось до момента наступления беременности; далее животные находились под наблюдением в течение месяца до наступления беременности. Для модели поздней ЗРП наложение лигатур на плацентарно-маточные сосуды проводилось на 25-й день беременности кролика (рис. 2). Беременность датировали от момента подсадки к самцу, на 14-й день проводилось УЗИ для подтверждения наличия беременности. Маточные сосуды перевязывались только в правом роге матки. Сосуды левого рога матки не перевязывались, и он считался «контрольным».
2) Процедура анестезии, одобренная локальным Этическим комитетом.
3) Хирургическая процедура моделирования ЗРП.
После бритья передней брюшной стенки и ее асептической обработки проводился разрез примерно 5 см в длину по срединной линии, в нижней трети живота; далее методом острого и тупого рассечения послойно были вскрыты ткани передней брюшной стенки. Матка была полностью экстериоризирована в операционное поле, обложенное марлевыми салфетками, смоченными подогретым физиологическим раствором. После определения маточно-плацентарных сосудов для каждого гестационного мешка происходила перевязка 30–40% этих сосудов; перевязка проводилась только в одном роге, второй рог оставляли интактным. После завершения манипуляции матку осторожно возвращали в брюшную полость, которая далее была ушита послойно.
Ультразвуковое исследование
УЗИ выполняли на 20-й и 27-й день гестации кроликов Оryctolagus cuniculus (общая продолжительность беременности составила 30 дней). Перед исследованием проводилась подготовка передней брюшной стенки кролика для оптимального сканирования. Во время УЗИ не использовалась анестезия; кролики удерживались на руках второго исследователя. УЗИ проводилось с использованием линейного датчика с высоким разрешением 12–5 МГц. Для сканирования были выбраны по 2 плода из каждого рога одной самки, которые располагались наиболее поверхностно и были доступны для осмотра и надежной идентификации во избежание повторных измерений у одного плода. Первое УЗИ было проведено на 10-е сутки после спаривания для верификации беременности и определения числа плодных мешков.
Ультразвуковая фетометрия проводилась согласно ранее описанной методике Coombs P. et al. [3]. Для измерения окружности головы (ОГ) была выбрана коронарная плоскость, где серп и таламус использовались для определения уровня, на котором можно было получить максимальный бипариетальный размер (рис. 3а). Окружность живота (ОЖ) измерялась в аксиальной плоскости живота на уровне желудка и пупочной вены, наружный контур определялся с использованием эллипса (рис. 3b). Длина бедра (ДБ) измерялась при получении изображения максимальной длины метафиза бедренной кости (рис. 3с). Также проводилась оценка пульсационного индекса (ПИ) артерии пуповины с использованием спектрального допплеровского режима (рис. 4).
Статистический анализ
Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Распределение всех исследуемых количественных показателей отличалось от нормального. Количественные данные представлены с помощью медианы (Me) и межквартильного размаха IQR=(Q1–Q3). Для определения статистической значимости различий двух групп использовался U-критерий Манна–Уитни, при множественных сравнениях между количественными параметрами использовался критерий Краскела–Уоллиса, апостериорные сравнения проводились с помощью критерия Данна с поправкой Холма. Гипотезу о равенстве средних значений в исследуемых группах отвергали при уровне значимости p<0,05. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Jamovi версии 2.4.8.
Результаты
Результативность экспериментальной модели
При моделировании ранней ЗРП, включающей лигирование маточных сосудов на небеременной матке, 2 самки были исключены из исследования: одна – в связи с развитием гнойно-септических осложнений, вторая – в связи с отсутствием беременности; 3-я самка была исключена из финального этапа исследования в связи с мертворождением на 28-й день гестации.
Оценка фетометрии плодов Оryctolagus cuniculus на 20-й день гестации
При анализе фетометрии плодов кролика на 20-й день гестации для модели ранней ЗРП (перевязка маточных сосудов одного рога до беременности) и контрольной группы было установлено, что основные показатели значимо различались между исследуемыми группами. Наименьшие значения ОГ (41,0 (IQR 39,5–42,1) мм), ОЖ (48,8 (IQR 46,7–49,7) мм) и ДБ (4,7 (IQR 4,68–4,82) мм) наблюдались в экспериментальной группе ранней ЗРП; также было установлено, что у плодов из контрольной группы ранней ЗРП показатели фетометрии были выше, чем у плодов из экспериментальной группы, но ниже по сравнению с группой контроля (р<0,001, табл. 1, рис. 5). В то же время у плодов из экспериментальной группы ЗРП отмечалось повышение ПИ артерии пуповины по сравнению с группой контроля (1,87 против 1,56 соответственно, р<0,001).
Оценка фетометрии плодов Оryctolagus cuniculus на 27-й день гестации
При анализе фетометрии плодов на 27-й день гестации для модели ранней ЗРП (перевязка маточных сосудов одного рога до беременности) и поздней ЗРП (перевязка маточных сосудов одного рога на 25-й день гестации) было установлено, что наименьшие значения ОГ (50,5 (IQR 49,6–54,4) мм), ОЖ (60,8 (IQR 60,3–61,4) мм) и ДБ (6,25 (IQR 5,68–6,43) мм) наблюдались в экспериментальной группе ранней ЗРП и значимо различались по сравнению с другими группами (р<0,001, табл. 2, рис. 6). Для модели поздней ЗРП также были выявлены значимые различия: все параметры фетометрии (ОГ, ОЖ, ДБ) были значимо снижены у плодов из рога, где была произведена перевязка сосудов, по сравнению с плодами из контрольного рога (р<0,001); также было установлено, что у плодов из контрольной группы ранней ЗРП показатели фетометрии были выше, чем у плодов из экспериментальной группы, но ниже по сравнению с моделью поздней ЗРП (р<0,001, табл. 2, рис. 6). Отмечалось повышение ПИ артерии пуповины у плодов с ранней ЗРП (как экспериментальной (2,48, IQR 2,15–2,75), так и контрольной группы (2,44, IQR 2,30–2,56)) по сравнению с моделью поздней ЗРП (р<0,001). При моделировании поздней ЗРП отмечалось повышение ПИ артерии пуповины в экспериментальной группе по сравнению с группой контроля (1,83 против 1,57 соответственно, р<0,001).
Оценка веса новорожденных Oryctolagus cuniculus
От 13 крольчих было получено 37 живых плодов. Недостаточный рост плода при ЗРП подтверждается снижением массы тела новорожденного при рождении. При моделировании ранней и поздней ЗРП наблюдались значимые различия между исследуемыми группами (р<0,001). Медиана веса плодов в контрольной группе ранней ЗРП составила 29,5 (IQR 27,3–33,3) г, а в экспериментальной – 26,5 (IQR 20,5–28,8) г. При моделировании поздней ЗРП в контрольной группе медиана веса при рождении составила 49,5 (IQR 48,8–52,3) г, в экспериментальной группе поздней ЗРП – 34,0 (IQR 33,0–35,5) г.
Оценка веса плацент Oryctolagus cuniculus при рождении
Вес плацент в исследуемых группах также имел значимые различия (р=0,007). При моделировании ранней ЗРП массы плацент между экспериментальной и контрольной группами не различались (7,5 (IQR 5,5–8,0) г и 7,0 (IQR 6,0–8,3) г соответственно, р>0,05). При моделировании поздней ЗРП массы плацент в экспериментальной и контрольной группах значимо различались (4,0 (IQR 3,0–4,5) г и 7,0 (IQR 7,0–8,0) г соответственно, р=0,028) (табл. 3, рис. 7).
Обсуждение
В нашем исследовании для верификации моделирования ранней и поздней ЗРП проводилось УЗИ беременным самкам Оryctolagus cuniculus на 20-й и 27-й день гестации. При анализе фетометрии на 20-й день гестации отмечалось значимое снижение показателей фетометрии (ОГ, ОЖ, ДБ) в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой моделирования ранней ЗРП; однако показатели в обеих группах были снижены по сравнению с контролем (р<0,001). Схожая тенденция сохранялась и при проведении УЗИ на 27-й день гестации: показатели фетометрии продолжали отставать в экспериментальной группе ранней ЗРП по сравнению с контролем ранней ЗРП. При моделировании на 25-й день гестации поздней ЗРП отмечалось значимое отличие показателей фетометрии в экспериментальной группе. ОГ, ОЖ, ДБ были значимо выше у модели поздней ЗРП по сравнению с моделью ранней ЗРП. Наибольшее повышение ПИ артерии пуповины наблюдалось при моделировании ранней ЗРП; при моделировании поздней ЗРП ПИ артерии пуповины был выше в экспериментальной группе.
Coombs P. et al. (2020) [3] продемонстрировали возможность применения ультразвуковой биометрии плодов Оryctolagus cuniculus для оценки роста во время беременности на модели кролика, определив стандарты измерения основных показателей (бипариетальный размер, ОГ, ОЖ и ДБ). Также в ранее проведенных исследованиях – Chavatte-Palmer P. et al. (2008) [9] и DeKoninck P. et al. (2014) [11] были задокументированы фетометрические кривые роста плода у кроликов.
В нашем исследовании при моделировании ранней ЗРП, когда перевязка маточных сосудов в одном из рогов матки происходила до беременности, плоды как из экспериментальной, так и из контрольной группы имели меньшие показатели фетометрии и веса при рождении по сравнению с группой поздней ЗРП. Подобные результаты можно объяснить общим снижением перфузии матки и формированием коллатеральных артерий при лигировании сосудов до беременности, что привело к недостаточному поступлению питательных веществ ко всем плодам одной самки. В то же время при моделировании поздней ЗРП плоды из контрольного рога смогли полностью реализовать свой ростовой потенциал, а плоды из экспериментальной группы начали замедлять темпы роста на 27-й день гестации, однако их размеры превосходили таковые плодов из группы ранней ЗРП. Отмечается факт значимого уменьшения веса плаценты при поздней ЗРП по сравнению с ранней, объяснимый, вероятно, адаптационными механизмами при изначальном нарушении перфузии методом хирургической перевязки артерии.
В нашем исследовании у плодов с ЗРП отмечалось повышение ПИ артерии пуповины по сравнению с плодами из групп контроля. Lopez-Tello J. et al. (2015) [5] использовали модель ЗРП на кроликах с ограничением питания: на 21-й день ограничение в питании матери привело к значительному уменьшению размеров плода. При рождении фетометрические размеры новорожденных Оryctolagus cuniculus из исследуемой группы были значительно меньше (копчико-теменной размер, бипариетальный диаметр, поперечный грудной диаметр) и имели меньший вес по сравнению с контрольной группой. Ограничение кормления приводило к повышению ПИ пупочной артерии, а плоды с ЗРП демонстрировали компенсаторные эффекты, характеризующиеся снижением церебро-плацентарного отношения, по сравнению с контрольной группой [5]. В исследовании Hodges R. et al. (2013) [10] использовали хирургическую модель ЗРП на Оryctolagus cuniculus и показали, что плацентарная недостаточность проявляется отсутствием или обратным конечно-диастолическим кровотоком в артерии пуповины, что согласуется с сонографическими данными при формировании ЗРП у человека [10].
Данные Herrera E.A. et al. [12] показали схожие результаты в эксперименте, проведенном на морских свинках. Окклюзия маточных артерий индуцировала снижение скорости роста ОЖ плода (0,205 см в день (-1)), по сравнению с контролем (0,241 см в день (-1), р<0,001). ПИ артерии пуповины на 10-е и 20-е сутки после операции у плодов с ЗРП были достоверно выше по сравнению с группой контроля (р<0,01). Эти эффекты были связаны с уменьшением относительной площади просвета плацентарных артерий (21,3±2,2% против 33,2±2,7%, P<0,01) у свинок с ЗРП. Вмешательство в маточную артерию уменьшило вес плода (~30%), плаценты (~20%) и печени (~50%) по сравнению с контрольной группой [12].
При проведении исследования были выявлены основные ограничения в применении УЗИ у беременных самок Оryctolagus cuniculus: при большом количестве плодов (более 4) у одной самки невозможность качественной идентификации плодов затрудняет их отслеживание на поздних сроках гестации. Другим важным ограничением данного исследования является факт, что метод перевязки маточных артерий часто связан с высокими показателями гибели плода, особенно когда он выполняется на ранних сроках беременности и лигируется 40–50% сосудов [4].
Заключение
Селективное лигирование маточно-плацентарных сосудов является эффективным методом моделирования ЗРП у кролика (ранней и поздней форм), а использование УЗИ на внутриутробном этапе позволяет подтвердить, что проведенная операция была успешной и вызвала тяжелую плацентарную недостаточность.
