Невынашивание беременности ранних сроков представляет собой актуальную проблему современного акушерства, так как является полиэтиологическим состоянием, объединяющим различные нарушения как в репродуктивной системе, так и в организме женщины в целом [1].
Самопроизвольные выкидыши на ранних сроках встречаются в 15% среди всех зарегистрированных случаев беременности. При этом до 80% репродуктивных потерь приходится на I триместр [2].
На самом деле, число женщин с невынашиванием может быть несколько выше, так как часть самопроизвольных выкидышей происходит еще до обращения женщины к гинекологу в связи с фактом беременности [3]. Около 1–2% женщин страдают привычным невынашиванием беременности. Привычный выкидыш может быть связан с наличием хромосомных аномалий [4], тромбофилических состояний у матери [5, 6], а также с иммунными и эндокринными нарушениями [7, 8].
Среди причин преждевременного прерывания беременности одно из лидирующих мест занимают воспалительные заболевания [9]. Однако в 50% случаев причина выкидыша оказывается неустановленной [10]. Поэтому изучение причин невынашивания беременности до сих пор является одной из актуальных проблем в акушерстве и гинекологии.
Взаимодействие матери и плода является иммунологически уникальным, так как должно обеспечивать толерантность к аллогенному плоду и в то же время поддерживать защиту от возможных патогенов [11, 12]. В норме на ранних сроках беременности в эндометрии преобладает процесс иммуносупрессии, который обеспечивает толерантность организма матери к антигенам плода. Однако в присутствии инфекционного агента в децидуальной оболочке происходит сдвиг иммунного ответа в сторону активации иммунного ответа, что приводит к нарушению механизма толерантности к эмбриональным антигенам [13].
Система врожденного иммунитета является первой линией иммунной защиты из-за ее способности отличать инфекционное «чужое» от неинфекционного «своего» [14, 15]. Более того, активация врожденного иммунитета является ключевым шагом для развития антиген-специфического приобретенного иммунного ответа [16].
Толл-подобные рецепторы (TLR) – это сигнальные рецепторы системы врожденного иммунитета, экспрессирующиеся на клетках врожденного (неспецифического) иммунитета – моноцитах, макрофагах, дендритных и эпителиальных клетках, натуральных киллерах. Они распознают структуры бактерий и вирусов и способствуют запуску воспалительной реакции через активацию синтеза провоспалительных цитокинов [17].
В экспериментах на животных было показано, что TLR играют роль в патогенезе самопроизвольных выкидышей [18, 19] и могут оказывать влияние на апоптоз трофобласта [20].
Целью исследования было изучение особенностей экспрессии мРНК TLR 1-10 и основного фермента апоптоза каспазы-3α у пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности на сроке 6–10 недель.
Материал и методы исследования
Основную группу составили 57 пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности на сроке 6–10 недель (неразвивающаяся беременность, аборт в ходу). Из группы были исключены пациентки c доказанным эндокринным генезом невынашивания беременности, антифосфолипидным синдромом, наличием тяжелых экстрагенитальных заболеваний. У 66,7±6,2% пациенток данный выкидыш был вторым или более, что позволяет расценить эти случаи как привычное невынашивание беременности. В качестве группы контроля были обследованы 57 здоровых женщин, поступивших для проведения искусственного аборта на тех же сроках, с нормально протекающей беременностью. Пациентки c самопроизвольными выкидышами были сопоставимы c контрольной группой по возрасту (27,4±4,4 года и 26,4±3,9 года соответственно) и сроку гестации (7,37±1,39 недели и 8,22±1,36 недели соответственно).
Всем пациенткам проводилось анкетирование, общеклиническое обследование (общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови, коагулограмма), гистологическое исследование содержимого полости матки, эхографическое исследование на аппарате ESAOTE MyLab 20 (Нидерланды).
Экспрессию мРНК в эндометрии исследовали методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии с руководством MIQE [21]. Материалом для исследования экспрессии TLR 1-10 и каспазы-3α была ткань эндометрия, полученная при выскабливании полости матки. Образцы помещали в консервирующий раствор RNAlater (Ambion, США). РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с использованием реагента «Тризол» (Invitrogen, США). Затем образцы обрабатывали ДНКазой DNAse I RNAse free (Fermentas, США) для удаления геномной ДНК согласно инструкции производителя. Синтез кДНК проводили с использованием олигонуклеотидов и набора «Обратная транскриптаза Mint» («Евроген», Россия) на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия).
Количественную ПЦР выполняли на амплификаторе CFX96 (Bio-rad laboratories, США) с использованием набора qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия). Подбор праймеров генов осуществлялся с помощью базы данных BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). В качестве генов-нормировщиков использовали β-актин и пептидилпролилизомеразу А.
Полученные результаты выражали в относительных единицах (отн. ед.), вычисляя их по формуле: R=2–(Cq target-(Cq ref1+ Cq ref2)/2), где R – нормализованная экспрессия мРНК исследованных генов, Cq target – «пороговый» цикл (quantification cycle, Cq) исследованного гена, Cq ref1 и Cq ref2 – Cq генов-нормировщиков.
Статистическую обработку результатов производили с помощью программы Statistica 6.0, лицензия № AXXR505C705306FAN12 (Statsoft, США). Результат представляли как медиану (нижний квартиль; верхний квартиль), достоверность различий оценивали методом Манна–Уитни, так как результаты не подчинялись закону нормального распределения (по Колмогорову–Смирнову). Для корреляционного анализа использовали критерий Спирмена. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты исследования
Исходя из данных акушерско-гинекологического анамнеза было установлено, что общее количество беременностей у пациенток с невынашиванием и в контроле достоверно не отличалось. Однако у пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности было достоверно меньшее число родов (0,8±1,0 против 1,2±0,8 в контроле, p<0,01) и абортов (1,1±1,4 по сравнению с 1,8±1,2 в контрольной группе, p<0,01). Количество же самопроизвольных выкидышей в анамнезе у пациенток с невынашиванием, напротив, было значительно выше, чем в контроле (0,7±0,5 против 0,04±0,18 соответственно, p<0,01).
У пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности и у женщин, которым был произведен искусственный аборт, не было выявлено достоверных различий в частоте выявления гинекологических заболеваний, однако доля пациенток контрольной группы, у которых в анамнезе не наблюдалось гинекологических заболеваний, была достоверно выше, чем в основной группе (57,9±6,5% против 38,6±6,5%) (p<0,05). У пациенток с самопроизвольными выкидышами достоверно чаще наблюдались аллергические реакции на лекарственные препараты (15,8±4,8% против 1,8±1,7% в контроле) (p<0,05). Других различий в частоте экстрагенитальных заболеваний между двумя группами отмечено не было.
В общем анализе крови у женщин с невынашиванием отмечался достоверно более низкий по сравнению c контрольной группой уровень гемоглобина (124,61±1,72г/л) (131,19±1,72 г/л) (p<0,05), а также эритроцитов (4,13±0,06×109/л против 4,33±0,05*109/л соответственно) (p<0,05). Количество тромбоцитов и состав лейкоцитарной формулы у пациенток обеих групп достоверно не отличались.
По данным эхографического исследования было выявлено, что у пациенток с самопроизвольными выкидышами неразвивающаяся беременность наблюдалась в 57,8±6,5% случаев, анэмбриония – в 14,0±4,6%, аборт в ходу – в 28,1±6,0% случаев. По данным эхографического исследования у пациенток контрольной группы, которым впоследствии был произведен искусственный аборт, наблюдалась прогрессирующая беременность, соответствующая гестационному сроку.
По данным гистологического исследования серозный, гнойный и гнойно-некротический хориодецидуит были выявлены у пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности в 59,65±6,50% случаев, в то время как в контрольной группе – только в 19,30±5,23% (p<0,01). Дистрофические изменения в децидуальной ткани у женщин с невынашиванием наблюдались в 17,54±5,04% случаев, в то время как в контрольной – в 1,75±1,74% (p<0,05). Кроме того, в основной группе наблюдался тромбоз сосудов и очаги некроза в децидуальной ткани и гиалиноз сосудов децидуальной ткани. Для пациенток с прогрессирующей беременностью раннего срока в большинстве случаев (78,95±5,40%) было характерно отсутствие патологических изменений в эндометрии и хорионе.
Методом количественной ПЦР была изучена экспрессия TLR в эндометрии. У пациенток с самопроизвольными выкидышами наблюдалась достоверно более высокая экспрессия мРНК TLR3, лигандом которого является двухцепочечная вирусная РНК (таблица). Экспрессия мРНК TLR4 (лиганд-липополисахариды грамотрицательных бактерий), TLR6 (лиганд-липопептиды грамположительных бактерий и грибов) и TLR8 (лиганд-одноцепочечная РНК) была, напротив, достоверно ниже, чем в контрольной группе.
Была также изучена экспрессия в эндометрии мРНК каспазы-3α, которая является ферментом, способным запускать необратимый апоптоз трофобласта. Экспрессия мРНК каспазы-3α в эндометрии у пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности была достоверно выше, чем в контрольной группе.
Была выявлена отрицательная умеренная обратная корреляционная связь между экспрессией в эндометрии мРНК TLR6 и каспазы-3α в эндометрии (R=-0,52; p<0,01). Корреляционных взаимосвязей между экспрессией каспазы-3α и других TLR выявлено не было.
Экспрессия TLR6 имела умеренную положительную корреляцию с количеством родов (R=0,32; p=0,03) и слабую отрицательную корреляцию с количеством самопроизвольных выкидышей (R=-0,29; p=0,002) в анамнезе.
Обсуждение
Анализ иммунного статуса выявил, что экспрессия TLR3, лигандом которого является двухцепочечная вирусная РНК, в эндометрии была выше у пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности по сравнению c группой контроля. В настоящее время не подвергается сомнению тот факт, что вирусная инфекция играет важную роль в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков [22]. В литературе описаны результаты серии экспериментов на мышах, в которых была показана роль TLR, активируемых вирусными лигандами, в развитии самопроизвольных выкидышей. Полицитидиловая кислота, которая является лигандом TLR3, способствует резорбции как сингенных, так и аллогенных эмбрионов [23]. Блокада TLR3 специфическими антителами отменяет влияние полицитидиловой кислоты на эмбрион [24]. Кроме того, вирусная инфекция может влиять на исход бактериальной инфекции. Было показано, что у мышей, инфицированных вирусом герпеса, введение в половые пути бактериальных липополисахаридов приводит к выкидышу. В случае отсутствия герпес-вирусной инфекции беременность при введении липополисахаридов прогрессирует [25]. Можно предположить, что активация TLR3 приводит к увеличению реакции на бактериальные антигены.
В ряде исследований показано, что TLR3 является основным сигнальным рецептором, участвующим в запуске каскада апоптоза [26, 27]. В основе механизма апоптоза в этом случае лежит стимуляция выработки фактора некроза опухоли (TNF-α) вследствие активации белка сигнального пути TLR – нуклеарного фактора-kB (NF-kB). TNF-α, связываясь c рецепторами клеточной гибели, запускает каскад апоптоза [28].
В экспериментах in vitro был также показан проапоптотический эффект, наблюдаемый при стимуляции TLR1 и TLR2 в случае добавления пептидогликана в культуру клеток. При этом стимуляция TLR2 активировала каскад каспаз, приводящих к необратимой клеточной гибели. Однако этот эффект наблюдался только при блокаде TLR6 специфическими антителами. В том случае, когда экспрессия TLR6 не была блокирована, его активация переключала иммунный ответ с индукции апоптоза на стимуляцию провоспалительных цитокинов и элиминацию бактерий [29].
Согласно полученным результатам, у пациенток c невынашиванием беременности в эндометрии наблюдалось снижение экспрессии TLR6, которое имело достоверную отрицательную корреляционную связь с экспрессией каспазы-3α. Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что увеличение экспрессии каспазы-3α связано с отсутствием протективного действия TLR6.
Заключение
Таким образом, активация TLR3 и снижение экспрессии TLR6 являются важным фактором в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков. Можно предположить, что достаточная экспрессия TLR6 может играть протективную роль в эндометрии, способствуя предотвращению самопроизвольных выкидышей путем уменьшения явлений апоптоза.
