Ожирение – мультифакториальное заболевание, при котором страдают и снижаются многие функции мужского организма, в том числе и репродуктивная. Исследования, проведенные в нескольких популяциях, показали, что у мужчин с ожирением риск бесплодия более чем на 50% выше, чем при нормальном весе [1]. При избыточном весе ухудшаются как количественные, так и качественные параметры спермограммы, чаще выявляются олиго- и азооспермия [2].
Этиология и патогенез нарушения репродуктивной функции при ожирении до конца не ясны, однако в ряде работ была выявлена связь с изменением гормонального баланса: снижение уровня тестостерона и повышение продукции эстрогенов, изменения в гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси [3]. Ключевая роль в регуляции этих гормонов принадлежит ферменту ароматазе, осуществляющему превращение андростенедиона в эстрон и тестостерона в эстрадиол [4]. Синтез фермента кодируется геном CYP19A1, локализованным на длинном плече 15-й хромосомы в позиции 15Q21.1, состоит из 10 экзонов и имеет протяженный регуляторный участок, содержащий 10 промоторов, обеспечивающих тканеспецифичность фермента [5].
Известны полиморфные варианты гена CYP19A1 (полиморфизмы), влияющие на уровень экспрессии и активности фермента, что в свою очередь выражается изменением соотношения андрогенов и эстрогенов в организме [6]. Почти все исследования связи полиморфизмов гена CYP19A с уровнем репродуктивных гормонов были проведены на популяции женщин. В отношении мужчин на сегодняшний день показано наличие ассоциации качества сперматозоидов с длиной повтора ТТТА в 4-м интроне гена CYP19A1 [7]. Мужчины с более длинными повторами характеризовались более низким соотношением андрогенов к эстрогенам, что в свою очередь, коррелировало со снижением концентрации и подвижности сперматозоидов. Повышенный уровень эстрогенов был выявлен также у мужчин с минорным аллелем полиморфизма rs700518 (А) [8].
Целью настоящей работы было сравнить частоту полиморфизмов rs2414096 (A/G), rs749292 (A/G) и rs936306 (C/T) гена ароматазы (CYP19) у бесплодных и фертильных мужчин, страдающих ожирением.
Материалы и методы
Для определения роли полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 в развитии бесплодия у мужчин с ожирением были обследованы 85 мужчин европеоидной расы с ожирением (ИМТ более 30 кг/м²), которые были разделены на две группы: в основную группу были включены 50 мужчин с идиопатической патозооспермией, в контрольную группу были включены 35 фертильных пациентов.
Средний возраст больных в группах не имел достоверных различий и составил 33,1±0,8 года в основной группе и 31,2±0,8 года в контрольной (p>0,05). При анализе показателя индекса массы тела группы достоверно не различались – 33,2±0,7 и 31,3±0,6 соответственно (p>0,05).
Анализ результатов по количеству курящих пациентов, длительности курения и количеству выкуриваемых сигарет в день, частоте употребления алкоголя между изучаемыми группами не выявил статистически значимых различий.
Для молекулярно-генетических исследований использовали периферическую кровь, собранную в пробирки с ЭДТА. ДНК выделяли из 100 мкл крови с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба-ГС» (ДНК-технология, Россия). Определение полиморфизма гена ароматазы (CYP19) проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием флуоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда и анализа кривой плавления [9]. Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с использованием праймеров, наборов реактивов и детектирующего амплификатора ДТ-96, разработанных в ООО «НПО ДНК-Технология», Россия.
Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows@ v. 8.0, StatSoft Inc. (CША). Для оценки влияния генотипов на МПК использовали метод χ2 и вычисляли отношения шансов. Достоверность различия между сравниваемыми группами оценивали по методу Манна–Уитни для непараметрических данных.
Результаты собственных исследований
Данные, представленные на рис. 1, указывают на наличие ассоциации бесплодия у полных мужчин с присутствием в геноме аллеля А полиморфизма rs2414096. Встречаемость аллеля А у бесплодных мужчин составила 60% по сравнению с 42,9% в контрольной группе (р=0,03).У них также почти в 2 раза чаще, чем у фертильных мужчин, выявляется носительство гомозиготного генотипа АА. Риск развития бесплодия (OR) у полных мужчина при наличии аллеля А составил 2,0 (95% ДИ: 1,1–3,7).
Аналогичная ассоциация была обнаружена также для полиморфизма rs749292 (рис. 2). У бесплодных полных мужчин гомозиготный генотип АА встречался в 1,7 раз чаще, чем у полных фертильных мужчин (38,0 и 22,9%, соответственно). Риск развития бесплодия при наличии аллеля А полиморфизма rs749292 составил 1,92 (95% ДИ: 1,04–3,55).
Частота аллелей С и Т полиморфизма rs936306 в двух исследуемых группах была практически одинаковой: 81,4 и 18,6% соответственно, у фертильных полных мужчин и 83,0 и 17,3% у бесплодных (рис. 3).
В табл. 1 и 3 приведены результаты исследования гормонов в крови в зависимости от генотипа по полиморфизмам rs749292 и rs749292 у бесплодных мужчин с ожирением. Оба полиморфизма практически одинаково влияли на уровень исследованных гормонов – у носителей генотипа АА был значительно повышен в крови уровень эстрадиола, но снижена концентрация тестостерона, лютинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов.
Результаты исследования качества спермы у бесплодных мужчин с ожирением в зависимости от генотипа приведены в табл. 2 и 4. В отношении обоих полиморфизмов, rs749292 и rs749292, генотип АА ассоциировался с более низкой концентрацией сперматозоидов в эякуляте, с меньшей их подвижностью.
Обсуждение
До недавнего времени считалось, что эстрогены являются чисто женскими половыми гомонами. Однако имеются убедительные доказательства присутствия эстрогенов и в мужских гонадах [10]. У мужчин эстрогены были выявлены как в клетках Лейдига, так и в сперматоцитах и сперматозоидах [11]. Баланс между андрогенами и эстрогенами играет важную роль для нормального развития репродуктивной системы обоих полов. Ключевая роль в обеспечении этого баланса принадлежите Р450 ароматазе, обеспечивающей превращение части андрогенов в эстрогены. Генетические полиморфизмы кодирующего ароматазу гена CYP19A1 и влияющие на ферментативную активность могут приводить к частичному или полному нарушению репродуктивной функции у обоих полов [11, 12].
В проведенном нами исследовании была выявлена значительная ассоциация бесплодия у мужчин с ожирением с присутствием в их генотипе аллеля А полиморфизмов rs749292 и rs2414096 гена CYP19A1. Риск развития бесплодия у таких мужчин повышался почти в 2 раза. При оценке показателей спермограммы у пациентов с гомозиготной формой полиморфизмов rs2414096 и rs749292 (генотип АА) отмечалось значительное снижение концентрации сперматозоидов в эякуляте и меньшей их подвижностью.
У пациентов с генотипом АА по обоим полиморфизмам уровень ЛГ, ФСГ и тестостерона достоверно ниже, а уровень эстрогена выше, чем у мужчин с генотипами AG и GG. Повышение уровня эстрадиола, сопровождающееся снижением в крови концентрации гонадотропных гормонов, уменьшает выработку тестостерона клетками Лейдига и приводит к нарушению сперматогенеза. Кроме того, эти результаты указывают на то, что замена аденина на гуанин в полиморфных участках rs2414096 и rs749292 приводит к синтезу ароматазы с повышенной ферментативной активностью, сопровождающейся более активной ароматизацией тестостерона в эстрадиол. Ранее аналогичная связь аллеля А этих же полиморфизмов с повышенной активностью ароматазы была выявлена и у женщин [12].
