Роль метода ПЦР в диагностике врожденных и нозокомиальных инфекций у новорожденных

Ионов О.В., Никитина И.В., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е., Митрохин С.Д., Припутневич Т.В., Любасовская Л.А., Дегтярев Д.Н.

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва
Идентификация инфекционного агента является ключевым фактором в определении тактики проведения антибактериальной терапии, однако длительность микробиологического исследования приводит к запаздыванию старта этио-патогенетической терапии, выбору неоптимальной схемы лечения. Использование молекулярно-генетической идентификации микроорганизмов позволяет получить результат в течение нескольких часов.
Цель исследования. Определение роли и клинической значимости метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени в диагностике врожденных и нозокомиальных инфекций в периоде новорожденности.
Материал и методы. В работе проведено сравнение микробиологического и молекулярно-генетического методов идентификации микробных агентов в условиях отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных.
Результаты исследования. На основании 272 параллельно выполненных исследований показана высокая конкордантность использованных методов. При этом с помощью ПЦР результаты были получены врачами в 4 раза быстрее, чем идентификация чистой культуры при микробиологическом исследовании (предварительные посевы без определения чувствительности к антибиотикам) и в 8 раз быстрее, чем окончательные результаты микробиологического исследования.
Заключение. Метод ПЦР-диагностики является высокоточным, быстрым и может быть рекомендован для рутинной практики при совместном его использовании с традиционным микробиологическим методом при осуществлении инфекционного контроля в отделениях неонатологического профиля.

Ключевые слова

ПЦР в режиме реального времени
врожденные и нозокомиальные инфекции
диагностика
новорожденные

Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29.09.2011.

Одним из приоритетных направлений в современной неонатологии является выхаживание недоношенных детей с очень низкой (ОНМТ) и экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) при рождении. Данный контингент больных находится в зоне максимального риска по развитию нозокомиальных инфекций. C одной стороны, это связано с незавершенностью процессов формирования иммунного ответа у глубоко недоношенных детей, необходимостью длительного применения различных видов респираторной поддержки, постановки центральных сосудистых катетеров, осуществления большого числа заборов крови и других инвазивных процедур, с другой стороны, с особенностями госпитальной флоры, вносящей существенный вклад в реализацию нозокомиальных инфекций у новорожденных[1].

Возбудителями госпитальных инфекций являются условно-патогенные микроорганизмы (УПМ). Они широко распространены, устойчивы во внешней среде, а также обладают способностью к образованию биопленок [2]. В процессе антимикробной терапии условно-патогенные микроорганизмы приобретают резистентность к применяемым антибактериальным препаратам. Существенное значение в реализации инфекционных процессов среди пациентов реанимационных отделений придается группе так называемых ESKAPE-патогенов, к которым относятся Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp. [3].

Не вызывает сомнений также тот факт, что идентификация инфекционного агента является ключевым фактором в определении тактики проведения целенаправленной антибактериальной терапии или, напротив, ее отмены в случае отсутствия возбудителя.

Таким образом, именно с целью слежения за циркулирующей госпитальной микрофлорой, а также для обеспечения своевременной и быстрой идентификации возможных возбудителей врожденных и нозокомиальных инфекций в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН) ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова уже в течение 20 лет ведется регулярный микробиологический мониторинг, включающий выполнение дважды в неделю новорожденным посевов со слизистых оболочек (кал, зев), начиная с рождения. При наличии показаний дополнительно проводятся посевы отделяемого из трахеи, крови, мочи, ликвора, асцитической и плевральной жидкостей, отделяемого пупочной ранки, поврежденной кожи, конъюнктивы и других локусов.

Знание особенностей ESKAPE-патогенов и других УПМ, циркулирующих в реанимационном отделении, позволяет своевременно реагировать на клинически выраженное ухудшение состояния пациентов и назначать адекватную антибактериальную терапию [4, 5].

Основанием для исследования посевов материала из нестерильных локусов является широко известный феномен транслокации УПМ со слизистых оболочек в кровь и во внутренние органы [6–8] и наличие возможной причинно-следственной связи между патогенной флорой, контаминирующей ребенка, и инфекционным процессом.

В различных учреждениях в зависимости от уровня оснащенности микробиологических лабораторий результаты выполненных посевов могут быть получены в интервале от 3 до 10 дней. Позднее получение результатов микробиологических исследований приводит к запаздыванию старта этио-патогенетической антибактериальной терапии, к выбору неоптимальной схемы антибактериальной терапии, неоправданно широкому применению антибиотиков резерва, что, в свою очередь, в дальнейшем приводит к нарастанию мультирезистентности микроорганизмов [4, 7].

Наряду с традиционным выделением возбудителей микробиологическими методами в последние годы все большую актуальность приобретает использование молекулярно-генетических методов для более быстрой идентификации патогенов, способных вызывать течение инфекционного процесса у новорожденных, в том числе недоношенных детей с ЭНМТ и ОНМТ, находящихся в условиях отделения реанимации. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени позволяет идентифицировать возбудителя в биологическом материале в течение нескольких часов [9–12]. Вместе с тем, в силу относительной новизны методики, а также изменчивости микробного пейзажа стационаров, роль и клиническая значимость метода ПЦР в режиме реального времени в практике неонатальной реанимации до настоящего времени полностью не определена.

Таким образом, целью нашей работы было определение роли и клинической значимости метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени в диагностике врожденных и нозокомиальных инфекций у пациентов ОРИТН в периоде новорожденности.

Материал и методы исследования

В данное исследование были включены 68 детей различной массы и гестационного возраста, госпитализированных в ОРИТН ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова за период с января по сентябрь 2012 года, которым наряду со стандартными микробиологическими посевами, осуществлявшимися в рамках микробиологического мониторинга в отделении, проводилась также ПЦР в режиме реального времени для идентификации возможных возбудителей.

Были проанализированы 272 параллельно выполненных исследования (клинический материал забирали в одни и те же дни) по выявлению бактериальных агентов молекулярно-генетическим (ПЦР в режиме реального времени) и микробиологическим методами.

Материал для проведения плановых микробиологических исследований со слизистой зева и ануса новорожденных брали стерильными одноразовыми ватными тампонами и помещали в пробирку с транспортной средой Эймс с активированным углем. При наличии показаний получали отделяемое трахеи (в случае проведения искусственной вентиляции легких), кровь и другой биоматериал. Посевы крови и других в норме стерильных жидкостей проводили с использованием коммерческих флаконов с питательной средой для культивирования в автоматическом гематологическом анализаторе Bact/Alert (BioMerieux, США).

Показаниями для взятия крови на бактериологическое исследование были: дыхательные нарушения у детей при рождении, требующие проведения различных видов респираторной поддержки; клиническое ухудшение состояния новорожденных, связанное с развитием инфекционного процесса.

Для выполнения посевов использовались следующие питательные среды: 5% кровяной агар, среды Эндо и Сабуро, сахарный бульон. В течение 24–48 ч оценивалось наличие или отсутствие роста микроорганизмов. Идентификацию выделенных штаммов осуществляли параллельно двумя методами: по биохимическим показателям с использованием автоматического анализатора Vitec2Compact (BioMerieux, США) и протеомными методами с помощью масс-спектрометрии на масс-спектрометрометре AutoflexIII MALDI TOF MS (Bruker Daltonics, Германия) с программным обеспечением MALDI Biotyper.

Молекулярно-генетическое исследование крови и иных биологических жидкостей проводили методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Материал для проведения ПЦР-анализа собирали со слизистой зева, из ануса новорожденных и при наличии показаний из других локусов путем соскоба. Биоматериал помещали в пробирки с 500 мкл транспортной среды для биопроб (изотонический водно-солевой раствор с консервантом для соскобов, мазков) («ДНК-Технология», Россия). Кровь для проведения ПЦР-диагностики забирали в стандартную пробирку с ЭДТА в количестве 0,5 мл путем пункции интактной вены.

Нуклеиновые кислоты выделяли с помощью набора «Проба ГС» («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции. Амплификацию проводили на детектирующем амплификаторе ДТ-96 с использованием коммерческих реактивов («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции. Определяли следующие микробные агенты: Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus spp., Enterobacteriaceae, Escherichiae coli, Klebsiella pneumoniae/Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia, Citrobacter frendii, Burkholderia spp., Haemophilus spp.

Под spp. подразумевается группа микроорганизмов, которые относятся к данному роду, но могут не соответствовать роду в его систематическом понимании.

Результаты исследования

Спектр основной патологии среди детей, включенных в исследование, представлен в табл. 1.

Совпадение результатов микробиологических посевов и проведенной ПЦР-диагностики было выявлено в 75% случаев (204 исследования), в 70% из которых (142 исследования) возбудитель был идентифицирован, а в 30% случаев (62 исследования) молекулярно-генетические и микробиологические методы дали отрицательный результат. Детекция возбудителя методом ПЦР, не подтвержденная последующими микробиологическими посевами, определялась в 34 исследованиях (12%). Положительные микробиологические посевы при отрицательной ПЦР-диагностике были получены в результате 23 исследований (8%).

Полное несовпадение полученных результатов регистрировалось в 11 исследованиях (5%) (рис. 1).

Нами была оценена скорость получения результатов традиционного микробиологического исследования и исследования биоматериала пациентов методом ПЦР в режиме реального времени. Данные о сроках получения результатов анализов представлены в табл. 2.

Из таблицы видно, что результаты идентификации микроорганизмов методом ПЦР в режиме реального времени были получены врачами в 4 раза быстрее, чем результаты идентификации чистой культуры при микробиологическом исследовании (предварительные посевы) и в 8 раз быстрее, чем окончательные результаты микробиологического исследования с получением антибиотикограммы выделенных микроорганизмов.

Мы оценили значимость ПЦР-диагностики в ситуациях стремительного клинико-лабораторного ухудшения состояния новорожденных за счет нарастания инфекционного процесса в том временном интервале, когда результаты ПЦР-диагностики уже были получены, а результаты микробиологической диагностики были неизвестны, так как находились еще в работе. Среди возбудителей методом ПЦР наиболее часто детектировались: Staphylococcus spp. с геном метициллинрезистентности, в единичных случаях встречались Klebsiella spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia spp. Исходя из существующих в настоящее время подходов к лечению [4, 7], этим пациентам требовалась смена антибактериальной терапии.

При ухудшении клинического состояния новорожденных и при получении положительных результатов ПЦР-диагностики меняли антибактериальную терапию. Число таких детей составило 19, и на протяжении их пребывания в ОРИТН им было осуществлено 25 смен антибактериальной терапии. Следует подчеркнуть, что принятие решения об изменении антибактериальной терапии врачами и клиническим фармакологом Центра основывалось не только на данных молекулярно-генетической и микробиологической диагностики, но, в первую очередь, на клиническом ухудшении и нарастании лабораторных маркеров инфекционного процесса. В случае отсутствия отрицательной динамики в клинико-лабораторном статусе детей антибактериальная терапия не менялась. Схема выбора терапевтической тактики представлена на рис. 2.

Полученные позднее результаты бактериальных посевов полностью подтвердили результаты ПЦР-диагностики, а также правильность выбранной антибактериальной терапии.

Обсуждение

Учитывая совпадение в 75% случаев результатов проведенной одновременно ПЦР-диагностики и микробиологической диагностики образцов биоматериала из идентичных локусов, метод ПЦР в режиме реального времени следует признать достаточно информативным в диагностике нозокомиальных инфекций среди детей, находящихся на лечении в ОРИТН. Несовпадение полученных результатов может быть объяснено рядом причин. Положительные результаты ПЦР-диагностики, не подтвержденные впоследствии результатами микробиологических посевов, могут являться как ложно, так и истинно положительными. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены загрязнением используемых для работы реагентов (контаминацией), а истинно положительные результаты, вероятно, связаны с более высокой чувствительностью молекулярно-генетических методов исследования. Напротив, положительные результаты микробиологических посевов при отрицательных результатах ПЦР-диагностики могут быть связаны как с неточностью микробиологической идентификации микроорганизмов, так и с недостаточной чувствительностью отдельных молекулярно-генетических тест-систем.

B. Lucignano и соавт. показали, что метод ПЦР служит весьма ценным дополнением к микробиологическому исследованию крови у детей для диагностики инфекций кровотока, позволяя сократить время исследования до 6 ч и увеличить вероятность обнаружения возбудителя при низкой концентрации микроорганизмов в культуре крови [13]. Остается открытым вопрос, насколько колонизация пациента и наличие микроорганизмов в нестерильных локусах напрямую связаны с течением инфекционного процесса и необходимостью назначения антибактериальной терапии. По нашему мнению, лишь комплекс факторов, а именно: клинические признаки инфекционного токсикоза, повышение уровня маркеров течения воспалительного процесса (лейкоцитоз, нейтрофилез, увеличение значений С-реактивного белка и прокальцитониновый тест) наряду с идентификацией УПМ в нестерильных локусах может свидетельствовать о наличии прямой причинно-следственной связи между выявленным возбудителем и течением инфекционного процесса. Именно такая клиническая ситуация должна, по нашему мнению, являться предпосылкой для назначения или оптимизации проводимой антибактериальной терапии. При отсутствии необходимости быстрого принятия решения о смене антибактериальной терапии на результаты ПЦР-диагностики как самостоятельного метода без подтверждения его микробиологическим тестом ориентироваться не следует.

Не следует забывать, что проведение ПЦР-диагностики предполагает количественное определение специфических фрагментов ДНК возбудителей, что не всегда предполагает наличие живой формы патогенов [13]. Микробиологический метод, напротив, выявляет только живые микроорганизмы. Преимущество микробиологического метода заключается в возможности выявления любых микроорганизмов, способных к росту на определенных стандартами питательных средах, тогда как при ПЦР-методе спектр идентифицируемых микроорганизмов определяется набором специфических праймеров, входящих в состав используемой диагностической панели. Определение чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам также является преимуществом микробиологического метода, поскольку результаты антибиотикограммы являются основным опорным фактом при проведении антибактериальной терапии.

Высокая скорость идентификации возбудителей с помощью ПЦР (в пределах 6 ч от момента забора биоматериала) позволяет «работать с опережением», усилить санитарно-эпидемиологический режим в отделении и сразу по получении результатов анализов в случае необходимости предпринять меры по «виртуальной» или же реальной изоляции пациента.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:

  1. Метод ПЦР в режиме реального времени может быть использован как метод экстренной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний и УПМ в ситуациях стремительного клинико-лабораторного ухудшения состояния новорожденных, а также как уточняющий метод в случае затруднения микробиологической идентификации выделенной культуры.
  2. Микробиологический метод целесообразно использовать для изучения особенностей микробного пейзажа стационара, эпидемиологических наблюдений за динамикой антибиотикочувствительности с целью предотвратить формирование эпидемических вариантов возбудителей. Микробиологический мониторинг позволяет на основании знания наиболее вероятной чувствительности к антибиотикам выявленных микроорганизмов выбрать адекватную антибактериальную терапию в условиях дефицита времени при стремительном ухудшении состояния пациента до момента получения антибиотикограммы.
  3. Сочетание молекулярно-генетического и микробиологического методов диагностики в условиях стационара позволяет существенно повысить скорость и точность принятия клинических решений.

Заключение

Применение молекулярно-генетических методов является современным, мощным и клинически востребованным инструментом в диагностике внутриутробных и нозокомиальных инфекций у детей с ЭНМТ и ОНМТ. Метод ПЦР-диагностики в режиме реального времени является высокоточным, более быстрым в сравнении с применяемым традиционно микробиологическим методом и может быть рекомендован для рутинной практики при совместном его использовании с традиционным микробиологическим методом при осуществлении инфекционного контроля в отделениях неонатологического профиля.

Список литературы

  1. Venkatesh M.P., Placencia F., Weisman L.E. Coagulase-negative staphylococcal infections in the neonate and child: an update. Semin. Pediatr. Infect. Dis. 2006; 17(3): 120–7.
  2. Pace J.L., Rupp M.E., Finch R.G. Biofilms, infection, and antimicrobial therapy. Boca Raton: Taylor & Francis; 2006.
  3. Hemels M.A., van den Hoogen A., Verboon-Maciolek M.A., Fleer A., Krediet T.G. Shortening the antibiotic course for the treatment of neonatal coagulase-negative staphylococcal sepsis: fine with three days? Neonatology. 2012; 101(2): 101–5.
  4. Белобородова Н.В. Новые тенденции в антимикробной терапии тяжелых гнойно-воспалительных заболеваний у детей и значение антибиотиков группы карбопенемов. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2002;2: 56–60.
  5. Крапивина И.В. Микробиологический мониторинг патогенов внутрибольничных инфекций в стационаре: Автореф. дис. … канд. мед. наук. М.; 2010. 22 c.
  6. Брудастов Ю.А., Гриценко В.А., Журлов О.С., Брудастов А.Н. Свойства E.coli как факторы транслокации из кишечника во внутренние органы. Вестник Оренбургского государственного университета. Приложение: Биология и медицина. 2005; 5: 9–14.
  7. Припутневич Т.В., Любасовская Л.А., Ионов О.В., Никитина И.В., Приходько Н.А. Особенности микробной колонизации новорожденных, госпитализированных в отделение реанимации новорожденных. В кн.: Анестезиология и реанимация в акушерстве и неонатологии: Материалы V Всероссийского образовательного конгресса. М.; 2012: 107–9.
  8. Cole C.R., Hansen N.I., Higgins R.D., Bell E.F., Shankaran S., Laptook A.R. et al. Bloodstream infections in very low birth weight infants with intestinal failure. J. Pediatr. 2012; 160(1): 54–9; e2.
  9. Ионов О.В., Никитина И.В. Значение метода ПЦР в режиме реального времени в диагностике внутриутробных инфекций у новорожденных-пациентов ОРИТН. В кн.: Материалы Всероссийского научного форума «Мать и дитя». 25-28 сентября 2012г., Москва. М.; 2012: 416.
  10. Ионов О.В., Никитина И.В. Сравнительная оценка информативности метода ПЦР в реальном времени и микробиологического метода в диагностике врожденных и нозокомиальных инфекций у детей-пациентов ОРИТН. В кн.: Материалы Всероссийского научного форума «Мать и дитя». 25-28 сентября 2012г., Москва. М.; 2012: 417.
  11. Ohlin A., Backman A., Ewald U., Schollin J., Bjorkqvist M. Diagnosis of neonatal sepsis by broad-range 16S real-time polymerase chain reaction. Neonatology. 2012; 101(4): 241–6.
  12. Bloos F., Hinder F., Becker K., Sachse S., Mekontso Dessap A., Straube E. et al. A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis. Intensive Care Med. 2010; 36(2): 241–7.
  13. Lucignano B., Ranno S., Liesenfeld O., Pizzorno B., Putignani L., Bernaschi P., Menichella D. Multiplex PCR allows rapid and accurate diagnosis of bloodstream infections in newborns and children with suspected sepsis. J. Clin. Microbiol. 2011; 49(6): 2252–8.

Об авторах / Для корреспонденции

Ионов Олег Вадимович, кандидат медицинских наук, заведующий отделением реанимации и интенсивной терапии новорожденных отдела неонатологии и педиатрии ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-77. E-mail: o_ionov@oparina4.ru
Никитина Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, врач отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных отдела неонатологии и педиатрии ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: i_nikitina@oparina4.ru
Трофимов Дмитрий Юрьевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-49-51. E-mail: d_trofimov@oparina4.ru
Донников Андрей Евгеньевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-92. E-mail: a_donnikov@oparina4.ru
Бурменская Ольга Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-92. E-mail: o_bourmenskaya@oparina4.ru
Непша Оксана Сергеевна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-92. E-mail: o_nepsha@oparina4.ru
Припутневич Татьяна Валерьевна, кандидат медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории микробиологии отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 125430, Россия, Москва, ул. Митинская, д. 28, к. 1, кв. 255. Телефон: 8 (910) 414-56-16. E-mail: priput1@rambler.ru
Митрохин Сергей Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 143423, Россия, Московская область, Красногорский район, п/о Степановское, п. Истра, д. 20, кв.8. E-mail: s_mitrokhin@mail.ru
Любасовская Людмила Анатольевна, врач-бактериолог лаборатории микробиологии отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 142155, Россия, Московская область, пос. Львовский, ул. Садовая, д. 11, кв. 68. Телефон: 8(906) 074-42-46. E-mail: l_lyubasovskaya@oparina4.ru
Дегтярев Дмитрий Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела неонатологии и педиатрии ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России
Адрес: 117638, Россия, Москва, ул. Криворожская, д. 3, кв. 28. Телефон: 8 (495) 438-23-88. E-mail: d_degtiarev@oparina4.ru

Также по теме

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.