Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женского населения. В настоящее время в большинстве развитых стран мира 60–80% вновь выявленных случаев РМЖ подвергаются органосохранному лечению [1, 2].
Несколько крупных рандомизированных исследований наглядно показали, что нет статистически значимых различий в показателях безрецидивной и общей выживаемости среди пациентов, которым выполнялись либо мастэктомии, либо органосохранные операции [3–5].
Вместе с тем необходимо отметить, что риск местного рецидива после органосохранных операций остается более высоким, чем после выполнения мастэктомий и составляет в среднем 0,5% в год. Одним из наиболее значимых факторов местного рецидива является статус хирургических краев. В настоящее время хирургический край расценивается как «положительный» при наличии красителя на инвазивной опухоли или протоковой карциноме in situ (DCIS). Предпочтительным является отсутствие опухоли на расстоянии более 2 мм до окрашиваемого края резекции. «Положительные» края резекции являются причиной выполнения повторных оперативных вмешательств у 20–25% больных РМЖ после выполнения органосохранных операций [6, 7].
Ре-эксцизии сопровождаются более плохим косметическим результатом и неудовлетворенностью пациентов, увеличивают стоимость лечения. Вот почему хирургу крайне важно непосредственно во время операции получить максимально точную информацию в отношении краев резекции и тем самым снизить риск повторных хирургических вмешательств.
Золотым стандартом оценки краев резекции является морфологический метод исследования. Чувствительность и специфичность гистологического и цитологического методов составляют 73 и 98%, 89 и 92% соответственно [8, 9]. Недостатком морфологического метода является необходимость достаточного времени для его выполнения. Срочное гистологическое исследование в среднем занимает 20–40 минут, а цитологическое – 10 минут. Проведение интраоперационного ультразвукового исследования (УЗИ) требует меньшего времени – 3–6 минут, но характеризуется более низкой чувствительностью (75%) и специфичностью (81%) [10]. Кроме того, точность метода во многом зависит от квалификации специалиста. В настоящее время все большую популярность приобретает цифровая рентгенография удаленных образцов. Чувствительность и специфичность данного метода составляют 83 и 95% соответственно [11]. Выполнение исследования занимает всего несколько минут. Вместе с тем необходимо констатировать, что не всегда истинные размеры опухолевого узла совпадают с рентгенологическими.
Неудовлетворенность как точностью, так и временными затратами существующих методов оценки краев резекции, заставляет искать новые технологии. Одним из перспективных решений может быть применение масс-спектрометрии, которая позволяет анализировать молекулярный состав образцов и идентифицировать опухолевые клетки по наличию в них специфических белков и метаболитов. На данный момент разработано несколько масс-спектрометрических методов для анализа тканей: масс-спектрометрия с ионизацией быстрым испарением (rapid evaporative ionization mass spectrometry – REIMS) [12–14], метод десорбционной электрораспылительной ионизации (desorption electrospray ionization – DESI) [15–17], матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ) [18–20], вторично-ионная масс-спектрометрическая (ВИМС) визуализация [21–23] и др. Наиболее быстрым из перечисленных является метод REIMS, который относится к прямым масс-спектрометрическим методам, позволяющим проводить анализ образца без предварительной подготовки. На его основе уже разработан интраоперационный метод, названный «умный нож» (intelligent knife – iKnife) [14]. При использовании данного метода идентификация ткани происходит во время операции в режиме реального времени по характерному профилю масс-спектра рассекаемых тканей [14]. На сегодняшний день широкое применение «умного ножа» затруднено из-за его высокой стоимости и необходимости наличия масс-спектрометра в каждой операционной.
Масс-спектрометрия с распылением с ткани [24]
также относится к прямым методам, однако с его помощью можно исследовать материалы из нескольких операционных и он является более мягким методом по сравнению с REIMS, что позволяет получать информацию об интактных молекулах образца. Этот метод доказал свою эффективность при исследовании эндометрия и эндометриоидных тканей, рака легких, опухолей головного мозга [24–26].
Целью данной работы была оценка возможностей метода прямой масс-спектрометрии с распылением с ткани для идентификации нормальной и опухолевой тканей молочной железы.
Материал и методы исследования
Было проведено исследование 25 биоптатов злокачественных опухолей молочных желез и 25 биоптатов здоровых тканей, взятых из отдаленных от опухолевого узла участков этой же молочной железы, от 25 пациенток, находившихся на лечении в ФГБУ НЦАГиП им. В.И.Кулакова в 2016 году по поводу рака. Возраст больных колебался от 29 до 76 лет, средний возраст составил 51,6±12,0 года.
Макроскопически оценивалась общая локализация опухоли и ее локализация по квадрантам молочной железы, границы опухолевого узла, длина узла (максимальный размер в мм), ширина узла (максимальный размер в мм).
Микроскопические препараты исследовали методом обзорной микроскопии на световом микроскопе Olympus MX51 (Япония).
При обзорной микроскопии определяли гистологический вариант рака, степень злокачественности, наличие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов.
Помимо стандартного патоморфологического исследования все опухолевые образцы подвергались иммуногистохимическому исследованию (ИГХ), с помощью которого определялись наличие и уровень экспрессии рецепторов эстрогенов (клон SP1, Ventana) и прогестерона (клон 1Е2, Venatana) методом D.C.Allred, значение индекса пролиферации Ki-67 (клон 30-9, Venatana) и экспрессия белка her-2/neu (клон 4B5, Venatana).
Анализ молекулярного состава тканей проводили методом прямого распыления с ткани – разновидности масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией. При использовании данного метода кусочек ткани диметром 1–2 мм помещается непосредственно в источник ионов. Ткань омывается постоянным потоком 0,1% раствора муравьиной кислоты в метаноле. При этом непосредственно в источнике ионов происходит экстракция веществ из ткани в растворитель. Получившийся экстракт подвергается электрораспылению под воздействием приложенной между тканью и входом в масс-спектрометр разности потенциалов величиной 2900 В. Данный метод позволяет получать высокоинформативные масс-спектры веществ, содержащихся в тканях, с минимальной предварительной обработкой. Масс-спектры были получены в режиме положительных ионов на квадрупольном времяпролетном масс-спектрометре MaxisImpact (Bruker, Германия). Анализ одного образца занимал порядка 3 минут.
Полученные в результате эксперимента масс-спектры с помощью набораразработанных на языке R функций были преобразованы в табличную форму со столбцами соответствующими величине m/z и строками соответствующими отдельным образцам. В дальнейшем табличные данные выравнивали по среднему значению, масштабировали по методу Парето [27] и анализировали с помощью метода дискриминантного анализа ортогональных частных наименьших квадратов (orthogonal partial least squares discriminant analysis – OPLS-DA) [28]. Это метод многофакторного анализа с обучением. Наиболее существенные для классификации тканей молекулы определяли посредством анализа вклада переменной в проекцию (variable influence on projection – VIP), найденную с помощью OPLS-DA.
Молекулы, соответствующие наиболее значимым масс-спектрометрическим пикам, идентифицировали по точной массе и спектрам тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Точность определения m/z была не хуже 5–10 ppm.
Результаты и обсуждение
Все взятые образцы тканей до масс-спектрометрического анализа были гистологически верифицированы и охарактеризованы. На рис. 1 представлены характерные фотографии исследуемых образцов тканей.
Средние длина и ширина узла составили 8÷35 мм (М=21,68±7,56) и 5÷30 мм (М=15.84±6,10) соответственно. Самым распространенным гистологическим вариантом был неспецифический тип инвазивного рака (16 случаев, 64%), дольковый вариант рака был выявлен лишь в 3 случаях (12%). Также в 6 случаях были диагностированы особые варианты инвазивного рака молочной железы: в 3 случаях –
медуллярный рак (12%), в 2 случаях – апокриновый рак, в 1 случае – крибриформный вариант инвазивного. Иммунногистохимическим методом было выделено 5 молекулярно-генетических подтипов инвазивнго рака молочной железы: люминальный А составил 40% (10 случаев), люминальный B her2-негативный подтип – 28% (7 случаев), люминальный В her2-позитивный – 8% (2 случая), her2-позитивный и трижды негативный молекулярные подтипы составили по 12% (по 3 случая) соответственно.
С помощью прямой масс-спектрометрии в режиме положительных ионов определяли молекулярные профили опухолевой и здоровой ткани молочной железы. Оценку возможности классификации тканей на основе масс-спектрометрических данных и выявление потенциальных биомаркеров опухоли молочной железы проводили с помощью метода многофакторного анализа OPLS-DA. Этот метод является модификацией метода анализа главных компонент, направленной на выявление различий между изучаемыми группами, принадлежность образцов к которым заведомо известна. На рис. 2
представлен график счетов, построенный по результатам OPLS-DA анализа масс-спектрометрических данных. Точки на графике соответствуют отдельным образцам. Видно, что синие (образцы нормальной ткани) и красные (раковая ткань) точки сгруппировались в два кластера вдоль первой главной компоненты. Это свидетельствует о том, что, исходя из данных, полученных с помощью прямой масс-спектрометрии, можно отличить опухолевую ткань от здоровой ткани. На хорошее качество созданной статистической модели указывают и рассчитанные величины R2=88% и Q2=83%. R2 отображает долю данных, которую описывает модель с использованием скрытых переменных. Q2 показывает ожидаемую точность прогнозирования новых данных.
Анализ вклада независимых переменных, представленных масс-спектрометрическими пиками с различными m/z, в проекции, полученные в OPLS-DA модели, выявил 13 компонентов, наиболее существенных для классификации исследуемых тканей. Идентификацию этих компонентов проводили по их точным массам и МС/МС спектрам. Оказалось, что большинство выявленных методом прямой масс-спектрометрии веществ являются липидами. На рис. 3
приведены уровни наиболее значимых липидов, а именно диглицерида DG 34:1, фосфатидилхолинов PC 34:1, PC 32:0, PC 36:4, PC 38:4, PC 34:2, PC 32:1, PC 36:3, PC 34:0, LPC 16:0, PC 38:3, моноглицеридов MG 18:1, MG O-14:1, сфингомиелина SM 32:1. Уровень всех приведенных липидов, за исключением MG O-14:1, был повышен в опухолевых тканях. Повышенное содержание фосфадитилхолинов в злокачественных опухолях может быть связано с повышением уровня холин-киназы [29], которая в то же время стимулирует деление опухолевых клеток в молочной железе [30]. Обнаруженные повышенные уровни холин-содержащих соединений согласуется с исследованиями, посвященными разработке методов неинвазивной диагностики рака молочной железы и яичника методом магнитной резонансной томографии [30–33]. В этих работах было выявлено повышение общего содержания холиновых фосфолипидов в области опухоли. Изменение липидома тканей при злокачественной трансформации может отражать патологические процессы нарушения апоптоза и метаболизма клетки.
Заключение
Прямой масс-спектрометрический анализ тканей является быстрым и чувствительным методом, позволяющим проводить идентификацию паталогии тканей в течение нескольких минут. Помимо дифференцирования тканей, применение этого метода позволяет обнаружить характерные для рака молочной железы липидные паттерны, которые могут быть предложены в качестве диагностических биомаркеров.
Полученные в ходе исследования результаты показывают, что при раке молочной железы уровень ряда фосфатидитилхолинов повышен, что может свидетельствовать о нарушениях в процессах пролиферации.
