Неудачи имплантации в настоящее время остаются одним из лимитирующих факторов в эффективности программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Процесс имплантации зависит от наличия здорового эмбриона и рецептивного эндометрий, также важен продуктивный молекулярный «диалог» между этими составляющими. Эндометрий является восприимчивым для имплантации эмбриона достаточно короткий промежуток времени (1–3 дня) в середине лютеиновой фазы нормального овуляторного цикла, называемый окном имплантации, продолжительность которого определяется половыми стероидными гормонами, регулирующими экспрессию локально действующих факторов роста, транскрипционных факторов, молекул адгезии, цитокинов и хемокинов [1].
Основными продуцентами цитокинов являются иммунокомпетентные клетки, локализованные во всех органах генитального тракта женщины [2, 3]. Немалый вклад в синтез цитокинов вносят и клетки эпителия, выстилающего влагалище, шейку и собственно полость матки. Данный тип клеток выполняет не просто барьерную функцию, а представляет собой динамические иммунные клетки, которые могут играть основополагающую роль в определении иммунологического окружения генитального тракта [4].
Для успешной имплантации эмбриона и его развития на ранних сроках беременности необходимо наличие цитокинов, обладающих противовоспалительной/иммуносупрессорной активностью. Учитывая эффект плейотропного действия цитокинов, наличие воспалительных заболеваний в нижних отделах репродуктивной системы приводит к снижению вероятности имплантации эмбриона [2, 3].
Применяемый в рутинной практике метод микроскопии мазка с подсчетом числа лейкоцитов является достаточно субъективным и не может в полной мере отражать многогранность локального иммунного ответа.
Изучение профиля экспрессии мРНК ряда генов иммунной системы в соскобах эпителиальных клеток позволяет охарактеризовать состояние локального иммунитета слизистой влагалища в тот или иной момент времени [5], что может оказаться информативным для прогностической оценки эффективности программ ЭКО.
Материал и методы исследования
Нами было проведено проспективное клиническое исследование случай – контроль женщин репродуктивного возраста, проходивших лечение методом ЭКО и переноса эмбрионов в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава Росси.
В исследование были включены 67 женщин с бесплодием. Критериями включения в исследование были: возраст женщин от 18 до 42 лет, трубно-перитонеальный фактор бесплодия, регулярный менструальный цикл, сохраненный овариальный резерв, отсутствие патологии эндометрия по данным ультразвукового исследования, фертильная или субфертильная сперма супругов, наличие информированного согласия на проведение исследования. Исследование одобрено этическим комитетом НЦАГиП (протокол № 19 от 2.03.2012). Критериями исключения являлись: бесплодие, обусловленное иммунологическим фактором (наличие антиспермальных антител), миома матки любых размеров, острые воспалительные заболевания органов малого таза, олигоастенотератозооспермия III и IV степени (по нормативам ВОЗ, 2010 г.), пороки развития внутренних половых органов, cоматические и психические заболевания, являющиеся противопоказанием для вынашивания беременности и родов. Всем пациенткам проводили стандартное клинико-лабораторное обследование в соответствии с приказом Минздрава России №107н от 30 августа 2012 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению».
В зависимости от эффективности программы ЭКО, которая нами оценивалась по частоте имплантации из расчета на перенос эмбриона, пациентки были разделены на 2 группы: I группу составили женщины с «биохимической» беременностью (n=30); II группу – с отрицательным результатом (n=37).
Изучение профиля экспрессии генов проводили в день переноса эмбрионов в полость матки. В качестве биоматериала для исследований использовали соскобы слизистой оболочки заднебоковой стенки влагалища. Взятие материала для определения экспрессии мРНК генов иммунного ответа во избежание деградации РНК осуществляли в пробирки объемом 1,5 мл со специальной транспортной средой (лизирующий раствор набора «Проба НК» производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Оценку уровня экспрессии мРНК проводили с помощью количественной полимеразной цепной реакции с предварительной стадией обратной транскрипции в режиме реального времени коммерческими тест-системами («ДНК-Технология», Россия), согласно инструкции. Реакция амплификации проводилась с помощью детектирующего амплификата ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия).
В ходе исследования была проанализирована экспрессия мРНК 13 генов: цитокинов (интерлейкин (IL)1β, IL8, IL10, IL18, фактор некроза опухоли (TNF)α, трансформирующий фактор роста (TGFβ1), транскрипционных факторов (TBX21, GATA3, RORC2), толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4) и поверхностных маркеров клеток иммунной системы (CD45, CD68).
Нормировка уровня экпрессии генов выполнена с использованием метода сравнения индикаторных циклов (метод ΔCq) по трем референсным генам TBP, B2M, GUSB. В качестве меры центральной тенденции количественных признаков выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки – верхний (0,75) и нижний квартили (0,25). Результаты представлены в виде Ме (0,25–0,75). Для оценки значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна–Уитни для несвязанных совокупностей.
Всем пациенткам проводилась стимуляция функции яичников препаратами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона. Со дня пункции всем пациенткам проводили поддержку лютеиновой фазы дидрогестероном. Производили перенос 1—2 эмбрионов в полость матки. Имплантация оценивалась как положительная при уровне β-субъединицы человеческого хорионического гонадотропина более 20 МЕ/л (HCG STAT, Cobas).
Результаты исследования
Средний возраст обследованных женщин в I группе составил 33,4±3,4 года, во II – 33,0±4,8 года. Средняя продолжительность бесплодия не имела межгрупповых различий и составила 5,5±4,1 года и 5,3±3,1 года в I и II группах соответственно. Первичное бесплодие было выявлено у 47% женщин в I группе и у 43% во II, вторичное – у 53 и у 57% пациенток соответственно. Анализируя репродуктивный анамнез женщин со вторичным бесплодием, выявили, что наиболее частыми исходами предыдущих беременностей были искусственные аборты – 31,25 и 33,3%; частота самопроизвольных выкидышей составила 25 и 23,8%, доля внематочных беременностей – 56,25 и 52,3% в I и II группах соответственно.
В ходе исследования параметров фолликуло-, оогенеза и раннего эмбриогенеза было выявлено достоверное различие между группами по количеству полученных эмбрионов (p=0,02). В отношении остальных параметров значимых различий между группами пациенток выявлено не было (табл. 1).
В группе пациенток, у которых наступила «биохимическая» беременность, было отмечено статистически значимое повышение уровня экспрессии мРНК следующих генов: CD68 – 31,1 (27,1–63,7) о.е. против 21,9 (14,4–38,5) о.е. (р=0,034), GATA3 – 16,4 (7–51,1) о.е. против 5,3 (2–18) о.е. (р=0,004), IL18 – 200,6 (71,1–688) о.е. против 59,5 (16,1–165,2) о.е. (р=0,014), RORC2 – 0,07 (0,04–0,31) о.е. против 0,03 (0,02–0,06) о.е. (р=0,003).
Статистически значимые различия между уровнями IL10, TLR4, TLR2, TNFα, TGFβ1, TBX21, CD45 в I и II группах в ходе исследования не были выявлены (табл. 2).
В предыдущих исследованиях [6] было показано, что уровень экспрессии генов цитокинов коррелирует с наличием локальной воспалительной реакции. Интегральная оценка уровня экспрессии мРНК четырех генов иммунного ответа (TLR4, GATA3, TNFα, IL18), позволила выявить образцы с признаками локальной воспалительной реакции [7]. Согласно предлагаемому способу оценки локальной воспалительной реакции на основе молекулярных маркеров индекс воспаления может быть рассчитан по формуле: z=1,4*ln([TLR4]/ [GATA3])+1,3*ln([TNF]/[IL18])+7,8; где [TLR4]/[GATA3] и [TNF]/[IL18] – индексы соотношения уровней экспрессии соответствующих генов.
Все образцы были проанализированы с использованием данного метода. На основании полученного значения вероятности локальной воспалительной реакции образцы были разделены на соответствующие норме и соответствующие локальному воспалению (табл. 3).
Среди пациенток, у которых наступила имплантация, статистически значимо реже наблюдали экспрессионный профиль, соответствующий локальному воспалению (16,7 против 43,2%). Для успешной имплантации отношение шансов составило 0,26 (0,08–0,82, p=0,02) при наличии молекулярно-генетических признаков локального воспаления.
Обсуждение
Целью данного исследования было изучение экспрессионного профиля генов цитокинов и других маркеров в клетках слизистой влагалища с использованием молекулярно-генетических методов в день переноса эмбриона в полость матки для оценки прогностической значимости анализируемых показателей в результативности программ ЭКО. Было показано, что наступление «биохимической» беременности происходит на фоне повышения экспрессии мРНК генов CD68, GATA3, IL18, RORC2 и понижения – IL1β и IL8 в клетках слизистой влагалища.
Имплантация эмбриона зависит от многих факторов, одним из которых является «правильное» иммунологическое окружение. На сегодняшний день существуют неоспоримые данные о том, что процесс имплантации эмбриона находится под строгим контролем локально секретирующихся цитокинов [6, 8]. Во время имплантации и на протяжении всей беременности необходимо поддержание состояния иммунологической толерантности со стороны организма матери по отношению к генетически чужеродному эмбриону/плоду.
Существуют данные, связывающие неблагоприятный исход ЭКО с повышенным уровнем таких провоспалительных цитокинов, как TNF-α, IL-1β и IL-8 в вагинальном содержимом [9]. В ходе нашего исследования статистически значимые различия по уровню экспрессии генов указанных цитокинов между группами не были получены. Тем не менее, в группе с неэффективным лечением средний уровень экспрессии мРНК гена IL8 составлял 159,5 (95,9-411,2) против 102,2 (47,8-509,1) о.е. у женщин с «биохимической» беременностью. Уровень экспрессии мРНК гена IL1β составлял 170,7 (74,8-439,1) и 132,0 (33,9-562,2) в I и II группах соответственно, что согласуется с приведенными данными. Исходя из теории иммунологической толерантности, можно предположить, что неудачи ЭКО связаны с неблагоприятным иммунологическим окружением, обусловленным воспалительным фоном, проявляющимся повышением экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-8. Хотя стоит отметить, что для успешного процесса имплантации необходим определенный уровень данных цитокинов. В то же время чрезмерное повышение или понижение уровня экспрессии ведет к нарушению равновесия в системе, что приводит к неблагоприятным последствиям.
T.G. Wegmann с соавт. полагал, что успешная беременность является результатом преобладания Т-лимфоцитов 2-го типа (Th2) по отношению к Т-лимфоцитам 1 типа (Th1) [10]. Th1-ответ сопровождается повышением цитокинов IL-2, TNF-α и интерферона (IFN)-γ, обладающими провоспалительными свойствами, а Th2 – IL-4, IL-5 и IL-10. Данные ряда исследований показывают, что соотношение Th1:Th2 цитокинов значительно выше у женщин с привычной потерей беременности и невынашиванием, чем у нормальных фертильных женщин [11].
В нашем исследовании мы получили статистически значимое повышение экспрессии мРНК гена IL18 у женщин с наступившей беременностью. IL-18 активно вырабатывается эпителиальными клетками женской репродуктивной системы в процессе децидуальных изменений эндометрия под воздействием прогестерона для подготовки матки к имплантации эмбриона и развитию беременности [12, 13]. В отсутствие IL-12 присутствие IL-18 способствует поляризации наивных Т-лимфоцитов (Th0) в сторону Th2-ответа [12], тем самым способствуя поддержанию состояния иммуносупрессии, необходимого на всем протяжении беременности. Данное предположение подтверждается повышением экспрессии GATA3 в клетках слизистой влагалища в группе женщин с наступившей «биохимической» беременностью. GATA3 – транскипционный фактор, необходимый для дифференцировки Th2-лимфоцитов [14].
Экспрессия CD68 (маркер активированных макрофагов) повышена в группе женщин с «биохимической» беременностью. Повышенное количество макрофагов необходимо для поддержания баланса цитокинов для успешной имплантации эмбриона, а также для обеспечения защитной реакции на случай возможной инфекции [15, 16].
Согласно исследованиям M. Ruiz-Alonso с соавт., неудачи в программах ЭКО также могут быть обусловлены смещением окна имплантации и, как следствие, снижением рецептивности эндометрия [17]. Не стоит забывать, что состояние женской репродуктивной системы в целом и эпителия эндометрия в частности находится под постоянным контролем женских половых гормонов и подвержено циклическим изменениям. Изменение уровня экспрессии генов некоторых цитокинов в клетках стенки влагалища может косвенно отражать состояние фазы цикла и свидетельствовать о сдвиге окна имплантации в стимулированном цикле [18–20].
Заключение
Таким образом, оценка эксперссионного профиля генов врожденного иммунитета является значимым прогностическим фактором для оценки вероятности имплантации. Полученные данные свидетельствовуют об ассоциации изменения профиля экспрессии генов цитокинов в слизистой влагалища в день переноса эмбриона в программе ЭКО с успехом имплантации. Наблюдаемые изменения могут быть обусловлены как наличием сублинического локального воспаления, так и изменением гормонального фона, приводящего к изменению в системе локального иммунитета. Полученные данные могут служить основой для разработки принципиально новых диагностических методов, обепечивающих индивидуальный подход к лечению пациенток с бесплодием.
Профиль эксперссии, ассоциированный с неудачей, характерен для локальной воспалительной реакции. Таким образом, локальная воспалительная реакция является неблагоприятным прогностическим критерием для имплантации в программе ЭКО.
Исследование профиля экспрессии генов цитокинов в слизистой влагалища является перспективным направлением неивазивной диагностики и может быть использовано для индивидуализации тактики ведения пациенток в программе ЭКО.
