Миома матки – это доброкачественная моноклональная опухоль из гладкомышечных клеток миометрия [1]. Частота встречаемости миомы матки варьирует от 30 до 77% среди женщин репродуктивного возраста [1–3]. С миомой матки связано 5–10% всех случаев бесплодия [4]. В Российской Федерации миома матки является причиной гистерэктомии в 50–70% случаев [1, 3], в США по поводу миомы матки ежегодно выполняют более 200 000 гистерэктомий [5]. При этом общие экономические затраты на лечение данной патологии составляют 5,9–34,4 млрд долларов в год [6].
Миома матки является эстроген-зависимой опухолью, ведущая роль в фенотипическом проявлении цитогенетических, эпигенетических и молекулярно-генетических нарушений в клетках миометрия принадлежит половым гормонам [1, 2, 7, 8]. Согласно общепризнанным представлениям, основной причиной развития миомы матки является гиперэстрогения – повышенная продукция эстрогенов и/или повышенная чувствительность миометрия к эстрогенам, в том числе локальная; недостаточность лютеиновой фазы менструального цикла, прогестероновая недостаточность, хроническая ановуляция и повышенная продукция гонадотропных гормонов [3]. Одну из ключевых ролей в функционировании гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы женщины играет лютеинизирующий гормон, реализующий свои биологические эффекты через взаимодействие со специфическими рецепторами (LHCGR) [9].
В данном исследовании изучены ассоциации полиморфизма гена рецептора лютеинизирующего гормона (LHCGR) с развитием миомы матки. Согласно материалам базы данных GeneCards: The Human Gene Database (http://www.genecards.org/) ген LHCGR кодирует рецептор к лютеинизирующему гормону и хорионическому гонадотропину. Лютеинизирующий гормон, взаимодействуя со своими рецепторами, определяет синтез половых гормонов в яичниках, инициирует овуляцию, стимулирует функцию желтого тела, что имеет важное значение в этиопатогенезе миомы матки [1, 2, 3, 10].
Цель исследования – изучить ассоциации полиморфизма rs4374421, rs7579411, rs6729809, rs4953616 гена LHCGR с развитием миомы матки.
Материал и методы исследования
В исследование включены 1265 женщин: 569 пациенток с миомой матки и 696 женщин контрольной группы. Всем пациенткам с миомой матки (n=569, 100%) в гинекологическом отделении перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа была проведена гистерэктомия с последующей морфологической верификацией диагноза. В контрольную группу включались женщины, не имеющие клинических и ультразвуковых признаков доброкачественных пролиферативных заболеваний женской репродуктивной системы. Формирование контрольной выборки осуществляли при профилактических осмотрах (диспансеризации) женщин врачами перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. В выборки больных и контроля включались женщины русской национальности, являющиеся уроженками Центрального Черноземья России и не состоящие в родстве между собой. Формирование выборок проводилось за период с 2008 по 2013 гг. Средний возраст больных (43,22±8,35 года) и группы контроля (42,49±7,55 года) был сопоставим (по U критерию Манна–Уитни p>0,05). Исследование проводилось под контролем этического комитета медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета. У всех женщин предварительно было получено информированное согласие на проведение данного исследования.
Всем больным с миомой матки и женщинам контрольной группы проводилось типирование четырех полиморфных локусов rs4374421, rs7579411, rs6729809, rs4953616 гена LHCGR. Выбор этих полиморфных локусов для исследования обусловлен их значимым регуляторным потенциалом и влиянием на экспрессию генов (согласно базе данных HaploReg (v.4.1.) (http://compbio.mit.edu/HaploReg).
Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 8–9 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Геномная ДНК из периферической крови выделена стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Анализ исследуемых локусов осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов.
Для анализа соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди–Вайнберга, использовали критерий c2. Сравнение частот аллелей и генотипов между больными и контролем производили в таблицах сопряженности 2×2 с использованием критерия χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. Расчеты проводились в программе STATISTICA for Windows 6.0. Для изучения ассоциации полиморфизма с развитием миомы матки использовали логистический регрессионный анализ (тестировались аддитивная, доминантная и рецессивная генетические модели). Проведен анализ ассоциаций гаплотипов исследуемых полиморфных локусов с развитием заболевания методом логистической регрессии. Коррекцию на множественные сравнения проводили с помощью адаптивного пермутационного теста (pperm). Статистически значимым считали уровень pperm<0,05. Расчеты осуществляли в программе PLINK v. 2.050 (http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/).
Характер ассоциации полиморфных локусов с формированием заболевания оценивался с использованием показателя отношения шансов (ОR) и его 95% доверительного интервала (95% CI). При ОR>1 полиморфный вариант являлся фактором риска развития заболевания, ОR<1 – протективным фактором формирования заболевания и OR=1 ассоциация отсутствовала.
Регуляторный потенциал полиморфных локусов изучали с помощью онлайн программы HaploReg (v4.1) (http://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) [11]. Связь полиморфного локуса (референсного и альтернативного аллелей) с афинностью мотива ДНК к транскрипционным факторам оценивали по разнице между LOD scores альтернативного (alt) и референсного (ref) аллелей (ref) [12]. Отрицательное значение этого показателя свидетельствует о повышении афинности мотива референсным аллелем, наоборот, положительное значение демонстрирует связь альтернативного аллеля с повышением афинности анализируемого мотива ДНК.
Влияние полиморфизма на экспрессию генов (cis-eQTL) изучали с использованием данных проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) (http://www.gtexportal.org/). В работу включали данные с p<8×10-5, pFDR≤0,05. О направленности связи аллельных вариантов полиморфизма с уровнем транскрипции генов судили по коэффициенту линейной регрессии (β), который характеризует изменение нормализованного показателя генной экспрессии на один полиморфный (альтернативный) генетический вариант [13].
Результаты исследования и обсуждение
Анализ распределения генотипов по изучаемым полиморфным локусам rs4374421, rs7579411, rs6729809, rs4953616 гена LHCGR показал, что для всех локусов в группе больных миомой матки и в контрольной выборке эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди–Вайнберга (p>0,05). Результаты проведенного сравнительного анализа частот аллелей и генотипов полиморфных локусов гена LHCGR у больных миомой матки и в контрольной группе представлены в таблице. Выявлены ассоциации полиморфизма rs4374421 и rs7579411 с развитием миомы матки.
Установлено, что среди больных миомой матки частота генотипа T/C rs4374421 в 1,15 раза меньше чем в контроле (p=0,05). Данный генотип является протективным фактором развития заболевания (OR=0,78 95% CI 0,62–0,99).
Получено, что частота генотипа C/C rs7579411 в группе больных миомой матки в 1,23 раза выше, а встречаемость генотипа C/T этого локуса – в 1,12 раза меньше, чем среди женщин контрольной группы (p=0,02 и p=0,05 соответственно). Выявлена ассоциация аллеля Т rs7579411 с развитием миомы матки в рамках доминантной модели взаимодействия аллелей (p=0,01, pperm=0,02). Итак, генотип C/C rs7579411 гена LHCGR является фактором риска развития миомы матки (OR=1,35 95% CI 1,06–1,73), а аллель Т (OR=0,74 95% CI 0,58–0,94) и генотип C/T (OR=0,80 95% CI 0,63–1,00) этого полиморфного локуса имеют протективное значение при развитии заболевания.
Выявлено, что гаплотип ТС полиморфных локусов rs4374421-rs7579411 (данные полиморфные локусы находятся на расстоянии 3kb и сцеплены между собой, сила сцепления составляет r2=0,57, LD=-0,98) среди больных (58,85%) встречается чаще в сравнении с контрольной группой (54,85%, p=0,04, pperm=0,05). Таким образом, гаплотип ТС полиморфных локусов rs4374421-rs7579411 гена LHCGR является фактором риска развития миомы матки (OR=1,21).
С использованием онлайн программы HaploReg (v4.1) получено, что полиморфизм rs4374421 гена LHCGR расположен в регионе гистона H3K4me1, маркирующего энхансеры (в культуре клеток, предшественников нейронов и мезенхимных клеток, клетках эпителия молочных желез, клетках периферической крови и др.), и гистона H3K4me3, маркирующего промоторы (в культуре клеток, предшественников нервной ткани и др.), в регионе регуляторных мотивов ДНК, являющихся сайтами связывания с двумя транскрипционными факторами (NRSF_disc3 и Sin3Ak-20_disc6). При этом аллель Т, входящий в состав «рискового» гаплотипа, повышает афинность к транскрипционному фактору Sin3Ak-20_disc6 (различие между LOD scores аллелей Т (alt) и С (ref) составляет 11,1) и снижает афинность транскрипционному фактору NRSF_disc3 (различие между LOD scores аллелей Т (alt) и С (ref) составляет 7,8). Полиморфный локус rs7579411 гена LHCGR находится в регионе гистона H3K4me1, маркирующего энхансеры в культуре клеток, предшественников нервной ткани и мезенхимных клеток, первичных остеобластов и др.).
Таким образом, полиморфные локусы rs4374421 и rs7579411 гена LHCGR имеют значимые эпигенетические эффекты, что может быть медико-биологической основой их вовлеченности в развитие миомы матки. Согласно данным литературы, лютеинизирующий гормон играет одну из ключевых ролей в функционировании гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы женщины [9]. Свои биологические эффекты он реализует через специфические рецепторы (LHCGR). Биологические механизмы, связанные с действием лютеинизирующего гормона в организме (синтез андрогенов и эстрогенов в фолликулах, инициация овуляции, лютеинизация гранулезных клеток овулировавшего фолликула с формированием желтого тела, синтез прогестерона и других стероидов клетками желтого тела [9]) играют важную роль в этиопатогенезе миомы матки [1, 2, 3, 10]. Следует отметить, что литературные данные свидетельствуют о повышенном риске развития миомы матки при увеличении уровня лютеинизирующего гормона [14, 15].
С помощью онлайн-программы GTExportal (содержит данные об экспрессии генов в 48 различных органах и тканях) in silico выявлена связь полиморфизма rs7579411 гена LHCGR с уровнем экспрессии гена STON1-GTF2A1L в щитовидной железе (коэффициент линейной регрессии для аллеля Т равен β=-0,21, р=2,6×10-5, FDR≤0,05). Итак, аллель Т полиморфизма rs7579411 (имеет протективное значение для развития миомы матки) связан с пониженной экспрессией гена STON1-GTF2A1L, а соответственно аллель С этого полиморфного локуса, входящий в состав «рискового» гаплотипа, определяет повышенную транскрипцию гена STON1-GTF2A1L в щитовидной железе.
Данные, представленные в онлайн базе GeneCards: The Human Gene Database (http://www.genecards.org/) свидетельствуют, что в результате совместной транскрипции рядом расположенных генов STON1 и GTF2A1L образуется транскрипт STON1-GTF2A1L, определяющий синтез «обьединенного» белка, включающего основные элементы белков, кодируемых генами STON1 (stonin 1) и GTF2A1L (general transcription factor IIA subunit 1 like). При этом возможны несколько вариантов альтернативного сплайсинга, значение белковых продуктов которого к настоящему времени не известно. Следует отметить, что белковый продукт гена GTF2A1L (general transcription factor IIA subunit 1 like) входит в состав основного фактора транскрипции TFIIA, играющего важную роль в регуляции экспрессии генов. Белок, кодируемый геном STON1 (stonin 1), является одним из компонентов системы эндоцитоза клетки и участвует в процессах локальной адгезии и подвижности клеток (http://www.genecards.org/). Следует отметить, что в соответствии с полученными нами данными, полиморфизм rs7579411 гена LHCGR связан с уровнем экспрессии гена STON1-GTF2A1L в щитовидной железе. Согласно литературным данным, в щитовидной железе продуцируются гормоны йодтиронины, обладающие выраженными множественными метаболическими эффектами: регуляция процессов роста, развития и дифференцировки тканей и органов (особенно центральной нервной системы) – синергисты гормона роста, стимуляция синтеза белка и увеличение основного обмена, регуляция синтеза инсулина и углеводного обмена, липолитический эффект и активация синтеза холестерина (является предшественником половых гормонов) и др. [16]. Эти медико-биологические эффекты могут иметь важное этиопатогенетическое значение при развитии миомы матки [1, 3]. Имеются литературные данные об ассоциации полиморфных локусов, локализованных в регионе генов LHCGR, STON1-GTF2A1L с формированием синдрома поликистозных яичников в китайской популяции [17, 18] и повышенной экспрессии этих генов в образцах подкожной жировой ткани у больных поликистозом яичников [19]. В работе B.J. Davis и соавт. [20], показаны различия в уровне экспрессии транскрипта STON1-GTF2A1L в образцах миомы матки у черных и белых женщин старшей возрастной группы (35 лет и старше). Следует отметить, что данные о вовлеченности полиморфизма гена LHCGR в формирование миомы матки получены нами впервые.
Заключение
Таким образом, результаты работы свидетельствуют о значимой роли полиморфных локусов rs4374421 и rs7579411 гена LHCGR в формировании миомы матки. Факторами риска развития заболевания являются генотип C/C rs7579411 (OR=1,35) и гаплотип ТС полиморфных локусов rs4374421-rs7579411 (OR=1,21). Протективное значение для развития миомы матки имеют аллель Т (доминантная модель OR=0,74) и генотип C/T (OR=0,80) rs7579411, а также генотип T/C rs4374421 (OR=0,78). Эти полиморфные локусы имеют значимый регуляторный потенциал (расположены в регионе гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры в культуре клеток, предшественников нейронов и мезенхимных клеток и др., регионе регуляторных мотивов ДНК), а полиморфизм rs7579411 связан с уровнем экспрессии гена STON1-GTF2A1L в щитовидной железе.
