Проблема бесплодных браков ввиду нарастающей частоты во всем мире и в том числе в Российской Федерации является критически актуальной в связи с потенциальной угрозой воспроизводству населения и сохранению его генофонда. За прошедший 10-летний период эти цифры не имели существенной положительной динамики в различных популяциях, что позволяет констатировать сохраняющийся высокий процент неэффективных попыток ВРТ. Выбор эмбриона для имплантации играет критическую роль для успешного исхода планируемой беременности и основывается на морфологическом клеточном анализе эмбрионов [1, 2]. Первостепенной составляющей успеха в программах ВРТ может считаться эффективная оценка качества эмбрионов с целью их адекватной селекции, что позволит успешно повысить частоту наступления беременности и одновременно снизить частоту многоплодия. Однако поскольку эффективность морфологической оценки не абсолютна, до 70% полученных in vitro эмбрионов не имплантируются. Основной причиной этого являются количественные хро- мосомные аномалии с нарушением правильного числа хромосом в клетке (анеуплоидии), которые проявляются в потере или наличии дополнительной хромосомы или ее части.
Благодаря современным достижениям молекулярной генетики, на сегодня в целях преимплантационного генетического скрининга (ПГС) активно исследуется метод сравнительной геномной гибридизации (СГГ, Comparative genomic hybridization – CGH). CGH представляет собой технологию высокоразрешающего скрининга всего генома на предмет вариации числа копий отдельных его сегментов, что позволяет диагностировать анеуплоидии и микроструктурные хромосомные аномалии одномоментно во всех хромосомах [3, 4]. Этот метод обладает высокой разрешающей способностью, которая превышает
таковую в сравнении с кариотипированием более чем в 1000 раз. Даже после проведения полногеномной амплификации ДНК, выделенной из единичных клеток, разрешение метода позволяет определять как анеуплоидии целых хромосом, так и аномалии (делеции и дупликации) на субхромосомном уровне. Из существующих в настоящее время типов СГГ – на хромосомах и на микрочипе (последняя в англоязычной литературе носит название array-CGH, или aCGH, что переводится как матриксная CGH) – наибольшую диагностическую перспективу в клинической практике представляет метод array-CGН, называемый также «молекулярным кариотипированием» благодаря своей высокой разрешающей способности [5, 6].
Описание: Больная Б., 27 лет, поступила для проведении программы ЭКО с диагнозом: Бесплодие II трубного и мужского генеза (астенотератозооспермия 1–2-й степени).
В анамнезе:
– бесплодие в течении 4 лет. 2 внематочные беременности, двусторонняя тубэктомия. В феврале 2011 г. программа ЭКО в протоколе с антГнРГ (гонал Ф 150/1800), при трансвагинальной пункции получено 16 ооцитов, перенос 2 эмбрионов на стадии бластоцист. Биохимическая беременность, витрификация 3 бластоцист. В апреле 2011 г. криопротокол, перенос 2 эмбрионов на стадии бластоцист. Беременность не наступила. В октябре 2011 г. программа ЭКО в протоко- ле с антГнРГ (пурегон 100/1000МЕ), при трансвагинальной пункции получено 9 ооцитов, перенос 2 эмбрионов на стадии бластоцист. Беременность не наступила.
В феврале 2012 г. гистероскопия, ЦУГ-биопсия эндометрия, патологии не обнаружено. В марте 2013 г. программа ЭКО/ИКСИ в протоколе с антГнРГ (гонал Ф 150/1500 МЕ). 18.03.2013 произведена трансвагинальная пункция обоих яични- ков, получено 14 ооцитов. 11 ооцитов имели степень зрелости МII и были оплодотворены методом ИКСИ, на 1-е сутки развития нормальное оплодотворение наблюдалось у 11 клеток. На 2-е сутки было получено 11 эмбрионов, из них 3 – отличного качества, 7 – хорошего качества и 1 эмбрион удовлетворительного качества. На 3-и сутки культивирования было получено 8 эмбрионов, пригодных для проведения биопсии. 3 эмбриона остановились в развитии и были выключены из дальнейшего протокола культивирования. Биопсия проводилась по стандартной методике, иглами для биопсии бластомера HumagenMBB-BP-L-30 на установке микроманипуляторов Narishige, вспомогательный хетчинг был выполнен при помощи лазера Zilos- TK.
Сравнительная геномная гибридизация бластомеров проводилась с использованием оборудования фирмы Agilent (США). Полногеномную амплификацию ДНК исследуемых бластомеров проводили с помощью набора PicoPlex SingleCell WGA Kit (Rubicon Genomics, США). Качество и количество полученной в ходе амплификации ДНК контролировали с помощью 1,2% агарозного электрофореза. Мечение ампликонов проводили с помощью набора SureTag DNA labeling Kit (Agilent, США) согласно прилагаемой инструкции. Меченые ампликоны наносили на биочип Sure Print G3 8x60KCGH (Agilent, США), гибридизовали 16 часов, после чего проводили отмывку и сканирование на сканере биологических чипов SureScanMicroarrayScanner. Интерпретацию полученных результатов проводили с помощью программного продукта Agilent CytoGenomics 2.5.8.1.
Таблица. Результаты сравнительной геномной гибридизации эмбрионов согласно номенклатуре ISCN.
Методом сравнительной геномной гибридизации выявлено шесть эмбрионов с нормальным количеством хромосом и два с анеуплоидиями. У эмбриона № 2 установлена моносомия по хромосомам 7, 9, 10, 12, 21 и трисомия по хромосомам 11, 14 и 16. У эмбриона № 5 выявлена трисомия по хромосомам 2, 9 и 12. Эмбрионы № 2 и № 5 остановились в развитии на 3-и сутки. В эмбрионах № 1, 6, 7, 8, 9 и 11 анеуплоидии выявлено не было. Тем не менее, детальный анализ полученных данных позволил сделать вывод о наличии аномалий в 3-й хромосоме у эмбриона № 7, делеции в 13-й хромосоме у эмбриона № 8 и делеции в 18-й хромосоме эмбриона № 9. Эмбрион № 11, несмотря на отсутствие выявленной анеуплоидии, остановился в развитии на 3-и сутки. Таким образом, для переноса в полость матки были выбраны эмбрионы № 1 и № 6, в которых не было выявлено генетических нарушений (таблица). На 8-й день после переноса В-ХГ составлял 225 МЕ/л, по УЗИ в полости матки визуализируется два плодных яйца.
Заключение
Таким образом, впервые в России был успешно внедрен и проведен предимплантационный генетический скрининг с применением сравнительной геномной гибридизации на чипах. Широкое внедрение данной технологии позволит улучшить результативность программ ВРТ.
Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29.09.2011.
