Разработка новых малоинвазивных технологий лечения стрессового недержания мочи (СНМ) у женщин является одной из актуальных проблем современной гинекологии. Перспективным хирургическим подходом, способным обеспечить эффективное лечение и снизить частоту интра- и пост-операционных осложнений, является периуретральное введение объемообразующих средств, создающих в области трансплантации дополнительный объем соединительной ткани (дополнительный неконтролируемый сфинктер) и направленных на создание градиентного давления между мочевым пузырем и уретрой [1, 2].
Выбор материала объемообразующего средства обусловлен его медико-биологическими свойствами, прежде всего, биосовместимостью, низкой скоростью биодеградации и ограниченной миграцией из области введения. На сегодняшний день в арсенале врачей уже присутствуют десятки разнообразных объемообразующих препаратов, однако их общим недостатком является короткая продолжительность терапевтического эффекта [3].
В 2005 г. были опубликованы результаты первых экспериментальных исследований, где в качестве объемообразующих агентов стали использовать биорезорбируемые синтетические материалы на основе полимеров и сополимеров молочной и гликолевой кислот, а также поликапролактона и других алифатических полиэфиров [4–6]. Конечными продуктами биодеградации таких материалов являются водорастворимые и нетоксичные продукты нормального метаболизма, которые либо выводятся из организма естественным путем, либо претерпевают дальнейшую цепочку химических превращений плоть до углекислого газа и воды.
Синтетические биорезорбируемые материалы уже нашли широкое клиническое применение в виде шовного материала, винтов, пластин в других областях медицины, однако ни одного примера их клинического применения в отношении СНМ нами не обнаружено. При этом потенциал использования алифатических полиэфиров в тканевой инженерии огромен. Современные технологии позволяют получать на их основе частицы с заданными составом, размером, структурой и морфологией поверхности, скоростью резорбции, а также частицы с внедренными в них биологически активными веществами [7].
Формирование и модификация полимерных частиц и биоактивных композитов на их основе, как правило, подразумевает использование органических растворителей, остаточные примеси которых обладают выраженной степенью токсичности. Необходимость получения полимеров с минимальным содержанием примесей для нужд регенеративной медицины привела к разработке новой сверхкритической флюидной (СКФ) технологии пластификации и монолитизации полимерных композитов с использованием сверхкритического диоксида углерода (ск-СО2) [8]. Экологически чистый и безопасный ск-СО2 позволяет проводить обработку и модифицирование полимерных материалов, а также различных микро- и нанопористых структур практически при комнатной температуре (Ткр=31оС) с существенно более высокой эффективностью, чем при использовании обычных газов или жидких растворителей [9].
Таким образом, СКФ-обработка алифатических полиэфиров позволяет управлять структурой поверхности материала с одновременным удалением из него растворимых в ск-СО2 примесей, а температурный режим обеспечивает сохранность внедряемых биологически активных веществ [10, 11]. Это делает такие структуры идеальными матрицами-носителями для тканевой инженерии. Многокомпонентная система на основе подобной матрицы и стромальных клеток может оказаться более эффективной для лечения СНМ по сравнению с существующими объемообразующими препаратами за счет более выраженного и стабильного разрастания соединительной ткани вокруг уретры, обеспечивающего пролонгирование терапевтического эффекта [7].
Целью настоящей работы является оценка возможности использования различных вариантов микрочастиц алифатических полиэфиров, полученных с помощью СФТ, в качестве объемообразующего средства для лечения СНМ.
Материал и методы исследования
Изготовление экспериментальных образцов биорезорбируемых полимерных микрочастиц В качестве исходного сырья для получения полимерных микрочастиц использовали аморфные D,L-полилактиды (PL) различных молекулярных масс (от ~12 до ~100 кДа) марок PURASORB PDL02, PDL04, PDL05 с приведенной вязкостью от 0,2 до 0,5 дл/г и полилактогликолид (PLG) марки PURASORB PDLG07 с приведенной вязкостью 0,7 дл/г (PURAC Biochem bv, Нидерланды), а также низкомолекулярный поли-e-капролактон (PCL), Mw ~14000 (Sigma-Aldrich, США). В работе использовали диоксид углерода ОСЧ, ГОСТ 8050-85 (Балашихинский кислородный завод, Россия) без какой-либо дополнительной очистки.
СКФ-обработку для получения микрочастиц проводили методами PGSS (формирование частиц из насыщенного газом раствора) и СКФ-монолитизации с использованием оригинальных, разработанных и созданных в ИПЛИТ РАН, установок для получения полимерных микрочастиц [12].
Полученные экспериментальные образцы подвергали измельчению при -18°С с последующим фракционированием по размерам с помощью калиброванных сит с целью получения полимерных микрочастиц определенной дисперсности (100–150 мкм).
Сканирующая электронная микроскопия
Изучение морфологии поверхности исходных мелкодисперсных порошков алифатических полиэфиров и полученных микроносителей методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) проводили с помощью микроскопа LEO 1450 (Zeiss, Германия). Для этого исследуемые образцы помещали на проводящую (углеродную) клейкую ленту, на которую затем методом плазменного напыления наносили тонкую (0,05–0,1 мкм) пленку золота, обеспечивающую требуемую электропроводность их поверхности.
Получение и характеристика культур мультипотентных стромальных клеток пупочного канатика
Мультипотентные стромальные клетки (МСК) выделяли из пупочного канатика крысы (n=10) методом эксплантов. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12 (ПанЭко, Россия) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки до 10% (PAA Laboratories, США). Принадлежность выделенных клеток к МСК подтверждали в соответствии с требованиями ISCT (International Society for Cellular Therapy) [13].
Оценка цитотоксичности полимерных микроносителей
Оценку цитотоксичности исследуемых полимерных микроносителей выполняли в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-5-2009 «Национальный стандарт Российской Федерации. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro», введенным в действие 1 сентября 2010 года. Исследование проводили методом экстрактов с последующей количественной оценкой результата общепринятым МТТ-тестом, а также методом прямого контакта. В качестве тестирующей клеточной культуры использовали МСК пупочного канатика крысы на 2–3 пассажах.
Исследование адгезивных свойств полимерных микроносителей
Для оценки адгезивных свойств исследуемых полимерных микроносителей суспензию МСК пупочного канатика наслаивали на образцы, лежащие на дне культурального планшета. Для удобства фотосъемки образцы через 30 минут переносили в новые лунки и исследовали с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Оценка пролиферативной активности МСК при культивировании в присутствии полимеров
Оценку влияния полимерных микроносителей на динамику экспансии МСК пупочного канатика проводили с помощью системы xCELLigence System (Roche, Швейцария), разработанной для мониторинга за состоянием адгезионной клеточной культуры в режиме реального времени без использования метки. Принцип его работы заключается в измерении импеданса (комплексного сопротивления) клеток, считываемого с электродов специального микропланшета, с заданным временным интервалом. МСК пупочного канатика рассаживали в микропланшет из расчета 3 тысячи клеток на лунку. Через 24 часа в планшет помещали специальную вставку с пористой мембраной (диаметр пор 0,3 мкм). В эту вставку вносили образцы полимерных микроносителей, чтобы избежать их прямого контакта с клетками и электродами. В качестве контроля среды использовали пустую вставку, в качестве отрицательного контроля добавляли уродекс (Биополимер, Германия), в качестве положительного контроля (вещества, влияющего на динамику роста культуры) – ДМСО (Amresco, США). Общий срок наблюдения в режиме реального времени составил 7 суток.
Оценка пролиферативной активности МСК, адгезированных на поверхности полимерных микрочастиц
Суспензию МСК пупочного канатика наслаивали на образцы, лежащие на дне культурального планшета. Через 1, 3 и 7 суток образцы фиксировали 4% параформальдегидом (Merck, Германия) и окрашивали DAPI (Sigma-Aldrich, США). С помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000 B и программного обеспечения LAS AF v.3.1.0 build 8587 (Leica Microsystems CMS GmbH, Германия) снимали 10 полей зрения (увеличение х100) и подсчитывали число клеток и площадь поверхности каждой частицы в поле зрения. Полученные данные анализировали с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software Inc, США). Достоверными считали различия при p<0,05.
Результаты исследования
Получение экспериментальных образцов биорезорбируемых полимерных микрочастиц
Использование метода PGSS для формирования биорезорбируемых микрочастиц является эффективным для низкомолекулярных алифатических полиэфиров, в частности, D,L-полилактида PDL02 (Mw~12-16 кДа). Формирование плотных биорезорбируемых микроносителей из более высокомолекулярных полилактидов PDL04, PDL05 и полилактогликолида PDLG07, а также поли-e-капролактона PCL14, имеющих существенно большие времена биорезорбции в организме, проводили с помощью технологии СКФ-монолитизации полимеров с их последующим криоизмельчением. Микрофотографии поверхности экспериментальных образцов, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии, представлены на рис. 1.
Использование данных методик позволяет получать микрочастицы размером 50–200 мкм. В дальнейшей работе было предложено использовать частицы размером от 100 до 150 мкм, для чего использовали дополнительное просеивание через калиброванные сита. Верхняя граница обусловлена внутренним диаметром иглы 20G, которую предполагается использовать для трансплантации в эксперименте in vivo, нижняя граница обусловлена оптимизацией условий адгезии клеток к носителю.
Таким образом, всего было изготовлено 10 типов различных экспериментальных образцов биорезорбируемых полимерных микрочастиц (рис. 1).
Оценка цитотоксичности полимерных микроносителей
Исследование методом прямого контакта подтвердило отсутствие цитотоксического эффекта всех исследуемых образцов: при помещении микроносителей непосредственно в культуральную посуду не происходило изменения морфологии клеток (лизиса, нарушения целостности мембран, вакуолизации и т.п.) или их открепления от подложки (рис. 1 см. на вклейке). Количественную оценку проводили с помощью МТТ-теста, результаты которого представлены на рис. 2А.
Таким образом, все исследуемые образцы полимерных микроносителей получили оценку «0» («нецитотоксичен») по шкале цитотоксичности в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-5-2009.
Фазово-контрастная микроскопия также позволила выявить появление значительного количества мелких осколков в условиях культивирования в экспериментальных образцах, полученных с помощью PGSS или СКФ монолитизации из полимеров PDL02, PDL04 и PDLG07. Минимальное количество осколков и лучшую сохранность микрочастиц наблюдали в образцах PDL05-СКФ и PCL14-СКФ (рис. 1).
Пролиферативная активность МСК при культивировании в присутствии полимеров
В ходе исследования были предварительно отобраны два наиболее перспективных варианта микроносителей, обладающих наименьшей скоростью резорбции и лучшей устойчивостью к механическим воздействиям – полилактидный PDL05-СКФ и поликапролактоновый PCL14-СКФ. Анализ литературных данных показал, что эти образцы вызывают минимальный воспалительный ответ среди ряда синтетических биорезорбируемых материалов при подкожном введении экспериментальным животным [14, 15].
Влияние выбранных образцов на пролиферативную активность МСК было исследовано с помощью системы xCELLigence System. Данные о цитотоксичности изделий медицинского назначения, а также их возможном влиянии на динамику роста культуры, измеренные с помощью данной системы, имеют высокую степень корреляции с общепринятыми методами, основанными на оценке ферментативной активности, сохранности целостности мембран или прямом подсчете клеток [16].
Результаты эксперимента представлены на рисунках 2Б-В. Как видно из представленных результатов, оба выбранных носителя не оказывали негативного влияния на динамику роста МСК пупочного канатика. Если в контроле время удвоения клеточного индекса (то есть время удвоения популяции) составило 62,3±0,82 часа, то в лунке с добавлением PDL05 время удвоения составило 63,3±0,76 часа, а в лунке с добавлением PCL14 – 67,4±0,8 часа. При этом добавление уродекса увеличивало время удвоения до 70,8±0,96 часа, а ДМСО – до 129,1±1,52 часа. Таким образом, в обоих случаях ни сам материал микроносителей, ни продукты резорбции не были цитотоксичными и не снижали пролиферативную активность клеток.
Оценка пролиферативной активности МСК, адгезированных на поверхности полимерных микрочастиц
Микроносители на основе PDL05-СКФ и PCL14-СКФ обладают хорошими адгезивными свойствами: уже через 2 часа после добавления суспензии МСК пупочного канатика поверхность частиц была покрыта монослоем клеток, которые также образовывали клеточные мостики между отдельными частицами (рис. 3А см. на вклейке). Механическое воздействие (перенос микроносителей в другую лунку) приводил к разрыву таких мостиков, однако сами клетки оставались на поверхности носителя.
Распределение клеток по поверхности частиц было достаточно равномерным. Число адгезированных клеток, нормированное на единицу площади поверхности, значительно не изменялось между отдельными частицами и не снижалось при культивировании в течение 7 суток (рис. 3А см. на вклейке).
Подсчет клеточных ядер, окрашенных DAPI, показал, что между образцами PDL05-СКФ и PCL14-СКФ нет статистически значимых отличий через 1 и 3 сутки культивирования (349,3±25,9 и 348,6±24,5 клеток на 1 мм2 поверхности на 3-и сутки). При этом на 7-е сутки плотность адгезированных клеток на PDL05-СКФ была достоверно выше, чем на PCL14-СКФ (424,5±41,9 против 309,3±30,3 клеток на 1 мм2 поверхности). Данные представлены на рис. 3Б (см. на вклейке).
Заключение
На основании анализа морфологии, структуры поверхности, скорости резорбции, цитотоксичности и адгезивных свойств различных вариантов микроносителей из алифатических полиэфиров были отобраны два наиболее подходящих экспериментальных образца – PDL05-СКФ и PCL14-СКФ. Данные микроносители характеризуются оптимальными размерами и морфологией, стабильностью в условиях культуральной среды, не обладают цитотоксическим эффектом, не подавляют пролиферативную активность клеток, а также обладают выраженными адгезивными свойствами. В обоих случаях микроносители были получены с помощью технологии СКФ-монолитизации с последующим криоизмельчением. Данная технология позволит не только получать беспримесные микрочастицы с заданными свойствами, но и эффективно импрегнировать их таргетными ростовыми факторами, обеспечивая их постепенное высвобождение после трансплантации. На следующем этапе нашего исследования будет создана многокомпонентная система на основе СКФ модифицированных полимерных микрочастиц и МСК пупочного канатика и проведена оценка ее безопасности и эффективности лечения СНМ в эксперименте in vivo.
