Несмотря на значительные достижения в области вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), существенному проценту супружеских пар, прибегающих к ВРТ, не удается достичь наступления беременности после повторных попыток экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Повторные неудачи имплантации (repeated implantation failure – RIF) определяют как неспособность достижения клинической беременности после переноса по крайней мере четырех эмбрионов хорошего качества, как минимум в трех лечебных циклах ЭКО или криопротоколах у женщин в возрасте до 40 лет [1].
RIF – серьезная проблема, решению которой посвящено большое количество как клинических, так и фундаментальных исследований в области репродукции человека. Для выяснения причин RIF принято проводить гистероскопию для выяснения состояния эндометрия и хирургической коррекции выявленной патологии, сальпингэктомию в случае выявления гидросальпинкса, вспомогательный хэтчинг эмбрионов, проведение преимплантационного генетического скрининга эмбрионов и др., однако не всегда удается верифицировать причины RIF в программе ЭКО [2].
Наименее изученными являются иммунологические аспекты RIF.
Иммунологические аспекты повторных неудач имплантации
Молекулярные и иммунологические аспекты неудач имплантации – важная область исследований, заслуживающая отдельного внимания [3]. Особый интерес представляет процесс децидуализации, который является определяющим для наступления и пролонгирования беременности. Децидуальные стромальные клетки приобретают способность регулировать инвазию трофобласта и подавлять локальный материнский иммунный ответ [4, 5]. В литературе существует много противоречивых данных по значимости различных иммунологических исследований и различных видов иммунотерапии у женщин с RIF [6]. Нет консенсуса относительно необходимости скрининговых иммунологических исследований и пользы иммунотерапии.
Некоторые аспекты иммунных взаимоотношений матери и эмбриона до сих пор остаются неизвестными, несмотря на то что последние достижения в области молекулярной биологии позволили выявить некоторые иммунологические параметры, определяющие взаимосвязь между иммунными нарушениями матери и плода во время имплантации. Экспрессия неклассических молекул главного комплекса гистосовместимости (HLA), специфическая роль некоторых гормонов и цитокинов, функциональная активность клеток естественных киллеров в эндометрии и Т-регуляторных клеток представляют собой основные параметры, характеризующие формирование иммунологической толерантности матери к антигенам плода во время имплантации [7]. Доказана связь аберрантных иммунных ответов и несбалансированного цитокинового профиля с бесплодием, неудачами имплантациями после ЭКО и повторными выкидышами [3].
Успех имплантации зависит от качества эмбриона и его адекватной инвазии в децидуальную строму эндометрия. Под влиянием овариальных стероидов сложная многоступенчатая сеть локально действующих пептидов в эндометрии регулирует восприимчивость эндометрия, устанавливает «диалог» между матерью и эмбрионом и обеспечивает имплантацию бластоцисты [3]. Имплантация бластоцисты сама по себе вызывает асептическую реакцию в эндометрии, подобную воспалению, и определенные цитокины – лейкимию-ингибирующий фактор (LIF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), колониестимулирующий фактор (CSF1), интерлейкины IL-1β, IL-6, IL-10, IL-11, IL-15, фактор некроза опухоли (TNFα), трансформирующий фактор роста β (TGF-β) считаются главными модуляторами внутриматочных иммунных реакций [3]. Таким образом, эмбрион плохого качества, нарушение рецептивности эндометрия и аномальный «диалог» между эмбрионом и эндометрием могут привести к нарушению имплантации эмбриона.
К настоящему времени в области репродуктивной иммунологии достигнуты значительные успехи, свидетельствующие о том, что нормальное осуществление репродуктивной функции возможно благодаря наличию уникальных врожденных и приобретенных иммунологических механизмов.
Роль клеток естественных киллеров (NK) в имплантации
В процессе инвазии трофобласта важное участие принимают клетки естественных киллеров (NK-клетки). Аккумуляция NK-клеток эндометрия совпадает с периодом имплантации. NK-клетки эндометрия участвуют в контроле внутрисосудистой инвазии трофобласта и взаимодействуют с другими иммунными клетками, такими, как дендритные клетки и T‑лимфоциты [8]. При нормальной беременности NK-клетки функционируют скорее как нецитотоксические, секретируя цитокины, хемокины и ангиогенные факторы. Однако их цитотоксический потенциал против тканей плода и матери может проявляться во время инфекционного воспаления [9]. Известно, что NK-клетки эндометрия продуцируют различные цитокины и факторы роста, TNFα, IL-10, GM-CSF, IL-1β, CSF 1, LIF и интерферон-γ (IFN-γ). Меньшая часть NK-клеток поверхностного эндометрия с фенотипом CD56lowCD16+ имеет непосредственную связь с ворсинами хориона в межворсинчатом пространстве. CD56low-клетки продуцируют низкий уровень NK-производных цитокинов, но они являются мощными медиаторами естественной цитотоксичности [10].
Несмотря на то что количество NK-клеток эндометрия меняется во время менструального цикла, в ранние сроки беременности NK-клетки составляют около 70% всей популяции лейкоцитов в децидуальной оболочке. NK-клетки эндометрия участвуют в процессе имплантации эмбриона, инвазии трофобласта и последующем росте и развитии плаценты [11].
Полагают, что скопление NK-клеток эндометрия вокруг спиральных артерий децидуальной оболочки на ранних сроках беременности может быть связано с их влиянием на развитие и ремоделирование маточных спиральных артерий, количество и качество которых очень важно для успешного пролонгирования беременности [12].
Несмотря на то что роль NK-клеток эндометрия в привычном невынашивании беременности была показана в ряде исследований, остается малоизученным вклад этих клеток в неудачи имплантации эмбриона в программе ЭКО. С помощью метода проточной цитометрии оценили субпопуляцию лимфоцитов эндометрия у молодых пациенток с повторными неудачами имплантации в программе ЭКО. Было показано отсутствие различий в проценте эндометриальных CD56+CD16− и CD56brightCD16− клеток среди пациенток, включенных в исследование, по сравнению с долей субпопуляции тех же лимфоцитов эндометрия у пациенток с успешным исходом программы ЭКО [13]. Напротив, в работе Fukui и соавт. (1999) [14] было выявлено значительное снижение процента CD56brightCD16− клеток в образцах эндометрия пациенток с неудачной имплантацией в программе ЭКО по сравнению с контрольной группой. Неоднозначность этих результатов свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших исследований по оценке роли функциональных нарушений NK-клеток в патогенезе RIF.
Цитокиновый профиль и баланс Th1/Th2
T-лимфоциты, экспрессирующие антигенсвязывающий рецептор (TCRγ), являются источниками цитокинов Th1 и Th2-типов. Оптимальное соотношение Th1 и Th2-цитокинов в фетоплацентарной области является важным фактором, обеспечивающим резистентность к развивающемуся эмбриону на этапе его инвазии. Считается, что полноценной инвазии трофобласта способствует преобладание синтеза Th2-цитокинов (IL-4), что ограничивает цитолитическую и апоптогенную активность децидуальных клеток.
Получены данные о том, что мононуклеарные клетки периферической крови женщин с нормальной беременностью в анамнезе продуцируют значительно более высокие уровни цитокинов Th2-типа (IL-4 и IL-10), в то время как мононуклеарные клетки периферической крови у женщин с повторными самопроизвольными выкидышами в анамнезе секретировали значительно более высокий уровень Th1-цитокинов (IL-2, IFN-γ и TNF-α) [15].
Группа авторов [15] исследовали специфические ответы материнских мононуклеарных клеток периферической крови in vitro на аутологичные плацентарные клетки и антигены трофобласта, и выявили сдвиг в сторону продукции цитокинов Th2-типа стимулированными клетками женщин с нормальной беременностью в сравнении с мононуклеарными клетками периферической крови женщин с повторными самопроизвольными выкидышами в анамнезе.
Беременность определяют как антивоспалительное состояние за счет превалирования Th2-типа иммунного ответа, однако появились данные, указывающие на то, что для нормального процесса имплантации и инвазии трофобласта необходимо провоспалительное микроокружение и повышение продукции провоспалительных цитокинов [16]. В то же время высокие уровни провоспалительных цитокинов, связанные с наличием длительно текущих воспалительных заболеваний, могут отрицательно влиять на ранние этапы развития эмбриона [17]. Поэтому важно, чтобы перед наступлением беременности цитокиновая система была сбалансирована.
Kalu и соавт. (2008) [18] оценивали соотношение в периферической крови IFN‑γ/IL-4 и TNF-α/IL-4 женщин с RIF до проведения программы ЭКО и сравнивали их с аналогичными показателями в периферической крови у этих пациенток после аспирации ооцитов и показали, что данные соотношения могут быть предикторами неудач в программе ЭКО.
В настоящее время в литературе имеется единая точка зрения о повышении соотношения Th1/Th2-типа цитокинов в периферической крови пациенток с RIF, однако требуются дальнейшие исследования для изучения роли различных цитокинов в генезе RIF.
Роль Т-регуляторных клеток в имплантации
В формирование иммуносупрессии большой вклад вносят Т-регуляторные клетки (Тreg). У беременных Тreg-клетки составляют до 8% в периферической крови и до 20% от всех CD4+Т-лимфоцитов в децидуальной ткани. Основным методом определения Тreg является метод проточной цитометрии с использованием антител к CD4+ и CD25+-антигенам, а также к внутриклеточному маркеру – транскрипционному фактору Foxp3. Тreg являются важной составляющей в регулировании воспалительного иммунного ответа [19]. Многочисленные данные показывают, что Тreg крайне важны для материнской иммунной системы. Фенотипически эти клетки определяются как CD4+CD25+Foxp3+. Они способны осуществлять контроль толерантности к собственным антигенам и регулировать аутоиммунитет. Эти клетки влияют на фертильность, что доказывается их увеличением в лимфатических узлах мышей за 2 дня до оплодотворения [20]. Действительно, в эндометрии число Тreg увеличивается до овуляции, достигает пика в период овуляции и уменьшается во время лютеиновой фазы, что указывает на их ключевую роль в периовуляторный период менструального цикла [21]. Бесплодие также связано со снижением экспрессии мРНК FoxP3 в ткани эндометрия [22] и уменьшением CD4+CD25+FoxP3+-клеток в периферической крови в фолликулярной фазе менструального цикла у женщин после повторных неудачных программ внутриматочной инсеминации по сравнению с контрольной группой пациенток [23]. У женщин с RIF отмечается в том числе увеличение продукции цитокинов Th1-типа по сравнению с контрольной группой. Эта разница в продукции цитокинов отчасти является результатом снижения супрессирующей способности Т-reg [24].
Экспрессия HLA
Толерантность материнской иммунной системы к антигенам плода отцовского происхождения плода обеспечивается за счет экспрессии неклассических молекул HLA-системы клетками трофобласта. Трофобласт не экспрессирует HLA-антигены II класса, а также классические антигены I класса – HLA-А и HLA-В [25]. Однако установлено, что клетки вневорсинчатого трофобласта экспрессируют классические антигены I класса HLA-С и неклассические антигены I класса HLA-E, F, G [25].
Неклассические HLA-С антигены отличаются от А и В-антигенов высоким полиморфизмом. Периферические и маточные NK распознают HLA-С антигены с помощью иммуноглобулин-подобных рецепторов (KIR), вариабельная область которых представлена двумя гаплотипами, А и В. Рецепторы KIR, содержащие гаплотип А, обладают ингибиторной активностью, а рецепторы KIR c гаплотипом В способны активировать NK-клетки [26].
У женщин с привычными потерями беременности и частыми неудачами ЭКО, как правило, наблюдается низкое соотношение ингибирующих KIR и активирующих KIR на NK-клетках [27]. Результаты данных исследований свидетельствуют о значимости KIR и системы неклассических HLA-антигенов во взаимодействии и балансе активации и ингибирования активности NK-клеток для успешного осуществления процесса имплантации [28].
Важную роль в плодово-материнских взаимоотношениях играют рецепторы KIR2DL4 на поверхности NK-клеток, способные передавать им как активирующие, так и ингибирующие сигналы. Множественность функций взаимодействия KIR2DL4 с HLA-G играет важную роль при беременности. Подтверждением этому могут служить высокие уровни экспрессии KIR2DL4 маточными NK-клетками женщин с нормальным течением беременности по сравнению с уровнем экспрессии NК-клеток женщин с привычным выкидышем.
Таким образом, для оценки роли совпадений супружеских аллелей HLA-антигенов как риска RIF также необходимо проведение дальнейших исследований.
Иммунотерапия в преодолении RIF
В настоящее время отсутствует единая точка зрения на целесообразность использования различных видов иммунотерапии у женщин с неудачами имплантации в анамнезе.
Необходимость проведения иммунизации отцовскими лимфоцитами (LIT), часто использующейся в клинической практике, как предполагалось ранее, в настоящее время подвергается сомнению из-за возможных побочных эффектов для матери и плода в связи с непредсказуемым иммунным ответом как к аутологичным, так и к аллогенным компонентам крови [29].
Другим распространенным методом преодоления RIF является внутривенное введение иммуноглобулина (IVIg), которое широко используется с 90-х годов прошлого столетия, несмотря на разноречивые результаты о пользе применения этого метода. Результаты систематического обзора C. Coulam и B. Acacio (2012) показали, что IVIg повышает частоту родов у пациенток с иммунными нарушениями [30]. Однако мультицентровое рандомизированное плацебо-контролируемое исследование не показало существенных преимуществ IVIg при привычном невынашивании беременности [31]. Аналогично в двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании у 51 пары с RIF не продемонстрировано повышения частоты родов живым плодом после использования IVIg [6]. Таким образом, отсутствуют объективные данные о преимуществах использования IVIg у женщин с RIF.
Для преодоления RIF используют также интралипид – жировую эмульсию, которая подавляет аномальную активность в периферических NK-клетках женщин с RIF как in vitro, так и in vivo. Точный механизм модуляции иммунной системы интралипидом не ясен, однако полагают, что жирные кислоты в эмульсии служат лигандами для активации пролиферирующих активирующих рецепторов (PPARs), экспрессируемых NK-клетками. Активация этих ядерных рецепторов, как было показано, снижает NK-цитотоксичную активность, что приводит к повышению частоты имплантации и пролонгированию беременности. Возможность интралипида модулировать иммунную систему и позитивно влиять на имплантацию и пролонгирование беременности показана в единичных работах [32], поэтому необходимы дальнейшие исследования, прежде чем вводить терапию интралипидом при RIF в рутинную практику.
Обсуждается возможность положительного эффекта локального повреждения эндометрия (scratching) на имплантацию у женщин с RIF.
A. Barash и соавт. (2003) [33] впервые у пациенток с одной или двумя неудачами программы ЭКО проводили пайпель-биопсию эндометрия по крайней мере 4 раза в течение менструального цикла, предшествующего программе ЭКО. Установлено, что после локального повреждения эндометрия частота наступления беременности была существенно выше у пациенток с неудачами имплантации в анамнезе по сравнению с группой пациенток, у которых беременность наступила в первой попытке ЭКО (66,7% и 30,3%, р<0,05) [33]. В последующих работах также продемонстрирован положительный эффект локального повреждения эндометрия у пациенток с RIF [34–36]. S. Narvekar и соавт. (2010) [37], предложили проводить биопсию эндометрия дважды: в фазу пролиферации (7–10-й день менструального цикла) и фазу секреции (24–25-й день менструального цикла) перед планируемой программой ЭКО. В 2012 году группа авторов показала, что даже однократное проведение биопсии эндометрия на 5–7-й день менструального цикла перед проведением переноса эмбриона приводит к значительному повышению частоты наступления клинической беременности [38]. Механизм позитивного влияния локального повреждения эндометрия у пациенток с RIF не ясен. Обсуждаются следующие гипотезы: scratching 1) индуцирует децидуализацию эндометрия, что повышает вероятность имплантации; 2) увеличивает секрецию цитокинов, интерлейкинов, факторов роста, макрофагов и дендритных клеток, необходимых для имплантации; 3) нивелирует неблагоприятное влияние на эндометрий овариальной стимуляции в лечебном цикле и задерживает ускоренное созревание эндометрия, что способствует лучшей синхронизации между эндометрием и эмбрионом.
С целью повышения вероятности имплантации в программе ЭКО предпринимаются попытки воздействия на эндометрий путем введения в полость матки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF).
N. Lédée и соавт. (2011) [39] определяли прогностическую роль концентрации ряда различных цитокинов и факторов роста в фолликулярной жидкости пациенток, проходивших ЭКО в естественном цикле, и установили, что высокий уровень G-CSF является важным и достоверным прогностическим фактором наступления беременности и родов [39].
Gleicher и соавт. (2011) показали, что внутриматочное введение G-CSF повышало толщину эндометрия до 7 мм и более и привело к наступлению беременности у 4 пациенток с RIF и тонким эндометрием, ранее резистентным к препаратам эстрогенов и вазодилататоров, что свидетельствовало о повышении вероятности имплантации при использовании этого метода [40].
В исследовании W. Würfel и соавт. (2010) использование G-CSF у пациенток с RIF показало преимущества этого метода только у женщин с дефицитом активации генов KIR [41]. У этих пациенток нарушено взаимодействие между трофобластом и NK-клетками эндометрия через экспрессию HLA-C, что приводит к неудачам имплантации или выкидышу. Несмотря на результаты исследования L. Schlahsa и соавт. (2011) [42], показавшего, что G-CSF может быть мощным ингибитором NK-клеточной активности, влияние G-CSF на NK-клетки не вполне ясно.
Результаты систематического обзора 170 исследований показали эффективность использования G-CSF у пациенток с RIF, однако авторы обзора рекомендуют проведение дальнейших исследований, чтобы оценить целесообразность использования этого метода иммунотерапии при RIF [43].
Также с целью повышения вероятности имплантации в программе ЭКО обсуждается целесообразность использования кортикостероидных препаратов. В мета-анализе Boomsma и соавт. (2012), включавшем 13 исследований (1759 циклов), не выявлено явных доказательств, что использование кортикостероидов повышает вероятность имплантации в программе ЭКО [44]. Выявленное пограничное повышение частоты наступления беременности свидетельствовало о включении в исследования пациенток с иммунными нарушениями, которые могли быть устранены с помощью иммуносупрессивной терапии. Недостатками анализируемых работ авторы считали использование протоколов кортикостероидной терапии с различными препаратами (от преднизолона, метилпреднизолона и дексаметазона до гидрокортизона в комбинации с преднизолоном), дозами и длительностью применения кортикостероидов. В связи с этим в настоящее время отсутствует единое мнение об эффективности и целесообразности использования кортикостероидов при RIF [44].
В исследовании Nakagawa и соавт. (2015) [45] было показано, что иммуносупрессивная терапия такролимусом повышает частоту наступления беременности у пациенток с RIF и повышенным соотношением Th1 и Th2-цитокинов, однако это единственная работа, не позволяющая сделать окончательный вывод о возможности использования иммунодепрессанта такролимус у женщин с RIF [45].
Одним из новых методов иммунокоррекции при RIF является внутриматочное введение аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) в программе ЭКО.
Суть метода заключается в том, что МПК изолируют от пациентки и инкубируют с хорионическим гонадотропином человека (ХГч), чтобы активировать их в течение 2 дней. После этого активированные МПК вводят в полость матки для индукции дифференциации эндометрия. Через три дня производят перенос эмбриона на стадии бластоцисты в полость матки. Использование этого метода у пациенток с повторными неудачами имплантации в анамнезе повышало частоту имплантации и частоту клинической беременности [46]. Позднее было показано, что внутриматочное введение МПК без инкубации с ХГч также улучшает частоту имплантации в криоциклах, как с гормональной подготовкой, так и в естественном цикле у женщин, имеющих до 3 неудач имплантации в анамнезе [47].
Обсуждаются несколько механизмов действия данного вида лечения. Во-первых, МПК могут индуцировать дифференциацию эндометрия, что повышает вероятность имплантации эмбриона [48]. Во-вторых, хотя МПК и являются аутологичными клетками, они индуцируют воспалительные реакции в полости матки in vivo [49]. В-третьих, МПК могут секретировать протеазы, которые эффективно влияют на функцию и структуру поверхностных молекул, экспрессируемых на люминальных эпителиальных клетках эндометрия [49]. В-четвертых, МПК перемещаются из полости матки по направлению к строме, тем самым «указывая» путь для последующего прикрепления эмбриона и инвазии [50].
Наконец, МПК, активированные ХГч, вносят вклад в создание благоприятного иммунного микроокружения для имплантации за счет повышения иммунной толерантности, которая таким образом может быть индуцирована к наполовину чужеродному эмбриону [50].
Основанием для использования активаторов МПК стали данные о том, что ХГч усиливает продукцию цитокинов МПК, повышая имплантационные свойства эндометрия [51, 52].
Также было показано, что кортикотропин-рилизинг гормон (КтРГ) играет ключевую роль в стимуляции децидуализации эндометрия и формировании иммунологической толерантности иммунной системы матери к отцовским антигенам плода, индуцирует экспрессию Fas-лиганда (FasL), запуская апоптоз на активированных Fas-позитивных T-клетках [9]. Стимулирующее влияние МПК, активированных КтРГ, может быть обусловлено тем, что КтРГ является провоспалительным медиатором с максимальной экспрессией в период имплантации [53]. Поскольку имплантация характеризуется асептическим воспалением [54], КтРГ путем локального воздействия на эндометрий повышает способность к имплантации через асептическое воспаление [55], индуцируя децидуализацию эндометриальных стромальных клеток и усиливая эффекты прогестерона [56]. Данные результаты подтверждают целесообразность использования аутологичных МПК, обработанных ХГч и КтРГ, для внутриматочного введения при лечении женщин с RIF. Однако требуется дальнейшее проведение рандомизированных контролируемых испытаний для объективной оценки целесообразности проведения данного вмешательства.
Заключение
Таким образом, несмотря на положительные результаты единичных исследований о влиянии иммуномодулирующей терапии МПК на эффективность программы ЭКО, не изучена эффективность и механизм действия данного метода преодоления RIF. Сложный процесс имплантации бластоцисты включает в себя скоординированные во времени и пространстве эффекты многочисленных эндокринных и иммунных факторов. Имеются существенные доказательства, что нарушение экспрессии неклассических молекул HLA, дисбаланс цитокинов, а также изменение в количестве и активности NK-клеток, возможно, вносят свой вклад в нарушения репродуктивной функции. Более полное представление о гормональной модуляции иммунного микроокружения эндометрия позволит разработать новые персонифицированные терапевтические подходы для предотвращения RIF.
