Нарушение рецептивности эндометрия является одной из ключевых причин неудач имплантации бластоцисты в программах ЭКО. Поэтому в комплексе исследований функционального состояния эндометрия значительное место занимает изучение маркеров рецептивности для адекватной оценки и разработки лечебно-профилактических мероприятий. Наиболее достоверными показателями состояния рецептивности эндометрия являются следующие маркеры, определяемые в окно имплантации – лейкемия-ингибирующий фактор (LIF) и его рецептор (LIF-R), эстрогеновый рецептор (ER), прогестероновый рецептор (PR), гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), интерлейкины (IL)-1β, -2, -4, -6, -8, -10, -12 [1–5].
В последние годы установлено, что в рецептивности эндометрия участвует также эзрин или цитовиллин, один из белков, выявляемый во все фазы цикла в эпителии эндометрия [6]. Эзрин является одним из ключевых факторов, отвечающих за изменение клеточной мембраны, цитоскелета эпителиоцитов эндометрия и формирование и транспорт вакуолей в последних. Эзрин принадлежит к семейству ERM (Ezrin, Radixin, Moesin), входящий в надсемейство белков, связывающих мембранные белки с актиновым цитоскелетом [7, 8], участвует в процессах поверхностной адгезии, «миграции клеток» и ремоделировании экстрацеллюлярного матрикса. Эзрин находится в клеточной мембране в неактивной или нефосфорилированной форме, а при взаимодействии с тирозиназой активируется или переходит в фосфорилированную форму [7]. Экспрессия эзрина и его активация развивается под действием эстрогенов и факторов роста [9, 10]. В активированном виде фосфоэзрин связывается с различными лигандами, что потенциирует формирование ресничек и пиноподий, образование и транспорт вакуолей [8, 11, 12]. В межклеточных взаимодействиях эзрин играет важную роль в адгезии бластоцисты и имплантации ее в эндометрий [13].
По данным O. Tan и соавт. (2012) пик экспрессии эзрина в биоптатах эндометрия фертильных женщин отмечается в середину и конец секреторной фазы [14]. O. Tan и соавт. (2011) исследовали экспрессию общего эзрина (ir-ezrin), фосфорилированного эзрина (ir-p-ezrin) и взаимосвязь активации и локализации эзрина с цитологическими изменениями в эндометрии. Было установлено, что высокий уровень общего эзрина отмечался в средней фазе секреции в микроворсинках и пиноподиях. Уровень экспрессии и интенсивность окрашивания эзрина в железах повышается в области, окружающей секреторные вакуоли железистых клеток на пике эстрогена и прогестерона [6]. Однако данные об экспрессии эзрина в эндометрии в «окно имплантации» противоречивы.
Цель исследования: изучить морфологические особенности и экспрессию эзрина в эндометрии женщин с трубно-перитонеальным фактором (ТПФ) бесплодия и повторными неудачами программы ЭКО.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 60 пациенток с ТПФ бесплодия в возрасте от 26 до 38 лет, имеющих более 2 неудачных программ ЭКО в анамнезе (основная группа), и 20 здоровых фертильных женщин аналогичного возраста, имеющих в анамнезе здоровых детей (группа контроля). Пайпель-биопсия эндометрия проводилась в «окно имплантации» (ЛГ+7) и на 8–9-й день цикла для исключения хронического эндометрита. Для морфологического и иммуногистохимического исследования эндометрия материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. Образцы обрабатывали по общепринятой стандартной методике и заключали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Проводилось гистологическое исследование эндометрия с оценкой процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при х400 в 5 полях зрения. Иммуногистохимические реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4–5 мкм по общепринятым протоколам (DAKO protocols). Для выявления экспрессии эзрина использовали первичные антитела к эзрину (Epitomic, 1:100). Результаты иммуногистохимической реакции оценивали полуколичественным методом в баллах: отсутствие иммуноокрашенных клеток (–) – 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) – 0,5 балла; менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) – 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) – 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) – 6 баллов. По результатам исследования проводили статистический анализ с использованием метода дисперсионного анализа ANOVA (для нескольких групп) и по методу Манна–Уитни.
Результаты исследования
Большинство пациенток с ТПФ бесплодия были в возрасте от 25 до 38 лет. Длительность бесплодия в среднем составила 4,7±2,9 года, преобладало вторичное бесплодие. У 65% пациенток основной группы в анамнезе имели место 2 неудачных попытки ЭКО, у 25% женщин – 3, у 10% – 4 и более неудачных циклов ЭКО. Фертильные женщины контрольной группы были аналогичного возраста.
Анализ морфологической структуры эндометрия показал, что в «окно имплантации» у всех пациенток наблюдалась секреторная трансформация эндометрия. При этом ранняя стадия фазы секреции обнаружена у 24 (40%), средняя стадия фазы секреции – у 27 (45%) и поздняя стадия фазы секреции – у 9 (15%) пациенток основной группы, тогда как в группе контроля превалировал эндометрий средней стадии секреции – 16 (80%) (табл. 1, рис. 1 см. на вклейке).
Результаты иммуногистохимического исследования эндометрия показали, что в основной группе преобладали пациентки с количеством зрелых пиноподий менее 20% в поверхностном эпителии эндометрия (45%). В контрольной группе зрелые пиноподии выявлялись более чем на 40% поверхностного эпителия эндометрия у подавляющего большинства женщин.
Изучение поверхностного эпителия и оценка количества клеток с наличием пиноподий показала, что пиноподии в исследуемой группе покрывали в среднем 34±4,8% клеток поверхностного эпителия эндометрия (от 10 до 50% клеток). Почти в половине случаев (45%) пиноподии покрывали не более 20% клеток поверхностного эпителия. В контрольной группе пиноподии в среднем покрывали 45% поверхностного эпителия эндометрия.
При иммуногистохимическом исследовании эзрин выявляли в виде коричневого окрашивания апикальной мембраны эпителиоцитов эндометрия, в пиноподиях, в клеточной мембране и цитоплазме железистого эпителия и в строме. Изучаемое нами антитело обнаруживалось в виде как фосфорилированного активного белка, так и нефосфорилированного. Таким образом, мы определяли накопление в клетках общего эзрина.
Максимальная экспрессия белка обнаруживалась в пиноподиях и эпителиоцитах эндометрия в контрольной группе, тогда как в основной группе она была минимальной. В клетках стромы эзрин накапливался в чуть меньшем количестве в основной группе по сравнению с контролем (рис. 2 см. на вклейке).
Сравнительная характеристика экспрессии эзрина в ткани эндометрия у женщин с ТПФ бесплодия и у фертильных женщин в окно имплантации (ЛГ+7) представлена в табл. 2.
Как видно из данных таблицы, в исследуемой группе в эпителии эндометрия у 75% (45) женщин отмечался низкий уровень экспрессии эзрина (1–2 балла), у 25% (15) – средний уровень. Высокий уровень экспрессии эзрина в исследуемой группе не отмечался. Напротив, в контрольной группе низкий уровень экспрессии эзрина в эпителии эндометрия не отмечался ни в одном случае, а средний отмечался у 35% (21) женщин. Высокий уровень экспрессии эзрина в контрольной группе выявлен в 65% (39 пациенток).
В пиноподиях эндометрия в исследуемой группе выявлен низкий уровень экспрессии эзрина у 21 (35%) и средний уровень – у 33 (55%) женщин. Высокий уровень экспрессии эзрина выявлен у 9 (15%) женщин.
В контрольной группе в пиноподиях эндометрия у всех женщин отмечался высокий уровень экспрессии эзрина – 20 (100%).
В строме эндометрия в исследуемой группе у всех женщин выявлена низкая экспрессия эзрина – 60 (100%), а в контрольной группе у большинства – 51 (85%) женщин выявлена низкая экспрессия эзрина. Лишь у 9 (15%) женщин выявлен высокий уровень экспрессии эзрина.
Средний уровень экспрессии эзрина в «окно имплантации» в эпителии эндометрия в группе бесплодием составил 2,2 балла, а в контрольной группе – 5,3 балла, что статистически было достоверно ниже, р<0,05 (рис. 3). В пиноподиях эндометрия средний уровень экспрессии эзрина в основной группе также статически был достоверно ниже (3,8 балла) по сравнению с контрольной группой (6 баллов), р<0,05. В исследуемой группе в строме эндометрия средний уровень экспрессии эзрина статистически достоверно не различался от аналогичного показателя контрольной группы (1,6 и 1,9 балла соответственно, р>0,05).
Таким образом, выявлено снижение эзрина в пиноподиях и цитоплазме клеток эпителия эндометрия у бесплодных женщин, что свидетельствует о возможном нарушении адгезии бластоцисты, образования и созревания пиноподий, а также ремоделирования цитоскелета клетки. Указанные изменения проявляются в нарушении рецептивности эндометрия и его имплантационных свойств.
Обсуждение
Изучение поверхностного эпителия и оценка количества клеток с наличием пиноподий показали, что пиноподии в исследуемой группе покрывали в среднем 34±4,8% клеток поверхностного эпителия эндометрия (от 10 до 50% клеток), при этом в половине случаев (45%) – не более 20% клеток поверхностного эпителия. В контрольной группе пиноподии в среднем покрывали 45% поверхностного эпителия эндометрия.
В исследовании, проведенном G. Nikas и соавт. (2002), было показано снижение количества зрелых пиноподий у пациенток с бесплодием неясного генеза с нарушением имплантации эндометрия в анамнезе [15].
Наши данные согласуются с результатами предыдущих отечественных исследований, в которых была также показана значительная роль количества зрелых пиноподий в имплантации и созревании эндометрия [16–18].
В нашем исследовании мы выявляли общий эзрин, который, по данным литературы, изменяется в фазу пролиферации так же, как и фосфорилированный эзрин. Установлено, что эзрин действительно является важным фактором рецептивности эндометрия, так как обнаруживается в ключевых структурах эпителиоцитов – в пиноподиях и в цитоплазме, но преимущественно вокруг секреторных вакуолей эпителиоцитов эндометрия.
При исследовании иммуногистохимической экспрессии эзрина выявлено снижение его накопления в области пиноподий в основной группе по сравнению с группой контроля. В пиноподиях эндометрия исследуемой группы высокий уровень экспрессии эзрина выявлен у 9 (15%) женщин. В контрольной группе у всех пациенток (100%) выявлен высокий уровень экспрессии эзрина в эндометрии (р<0,05).
В среднем экспрессия эзрина в эндометрии женщин с бесплодием составила 3,8 балла, а в контрольной группе – 6 баллов (р<0,05), что также свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия и отражает нарушение его имплантационных свойств в исследуемой группе.
Полученные нами данные подтверждаются исследованием, проведенным в 2011 г. в Австралии, где показана ключевая роль белка эзрина в успешной имплантации эмбриона [19].
Таким образом, структурно-функциональные и молекулярные нарушения ремоделирования эндометрия в «окно имплантации» могут стать причиной нарушения его рецептивности.
Заключение
Прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются: наличие в период «окна имплантации» более 45% клеток поверхностного эпителия со зрелыми пиноподиями, а также высокий уровень экспрессии эзрина в пиноподиях и вокруг секреторных вакуолей в клетках поверхностного эпителия эндометрия. Эндометрий женщин с бесплодием характеризуется отставанием секреторных изменений, что проявляется образованием малого количества зрелых пиноподий, а также сниженной экспрессий эзрина.
