До настоящего времени одной из актуальных проблем перинатологии продолжает оставаться внутриутробная инфекция (ВУИ) [1, 2]. Известно, что инфекционно-воспалительные заболевания женщины в течение беременности являются факторами риска возникновения патологических состояний у плода, развивающегося в условиях тесного взаимоотношения с организмом матери [3, 4]. Острые инфекции могут приводить к потере беременности и/или рождению детей с пороками развития вследствие непосредственного инфицирования плода и плаценты и развития синдрома системного воспалительного ответа [5–8]. Хронические (латентные) инфекции, длительно персистирующие в организме матери, часто прогрессируют на фоне беременности и также могут приводить к внутриутробному инфицированию, плацентарной недостаточности, задержке роста плода и др. [1, 4, 9]. Кроме того, изменения в системе иммунитета вследствие персистенции вирусов могут приводить вторично к активации бактериальной флоры, развитию аутоиммунных нарушений и выступать причиной развития целого каскада патологических воспалительных реакций [3, 7, 10–12]. Следует отметить, что ранняя диагностика ВУИ не всегда возможна, так как симптомы инфекции часто не являются специфичными, а лабораторные тесты занимают немало времени. Вместе с тем прогнозирование, своевременная диагностика и адекватное лечение могут снижать риск развития тяжелых заболеваний у новоpожденных [6, 7, 13].
В последние годы показана роль однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) генов иммунного ответа в формировании генетически обусловленных различий в инфекционной резистентности и клиническом течении инфекционных заболеваний [5, 8, 14, 15]. Выше изложенное обосновывает поиск генетически обусловленных особенностей иммунной системы матери, влияющих на риск реализации ВУИ у плода и новорожденного [2, 5, 7].
Целью исследования стало создание модели прогнозирования ВУИ у новорожденных на основании изучения ассоциации клинических и молекулярно-генетических факторов.
Материал и методы исследования
Выполнено проспективное исследование случай-контроль. Проведен анализ особенностей клинической характеристики, течения беременности и ее исходов для матери, плода и новорожденного у 357 женщин. Все пациентки были разделены на две группы в зависимости от реализации ВУИ у новорожденного. Группу 1 (основную) составили 158 пациенток с реализацией ВУИ, группу 2 (группа контроля) – 199 женщин без реализации ВУИ.
Критериями включения явились: одноплодная доношенная беременность, критериями исключения: тяжелая экстрагенитальная патология, многоплодная беременность, пороки развития плода.
Всем беременным, включенным в исследование, был выполнен стандартный набор обследования. Они были ознакомлены с целью и методами исследования, дали письменное согласие на их участие в научном исследовании.
У пациенток изучено распределение аллелей и генотипов функционально значимых полиморфных локусов генов врожденного иммунитета: интерлейкин (IL) 6R: 1510 (1073) A>C (Asp358Ala), IL6: -174 C>G, IL10 -592 A>C, TLR9: -1486 T>C, IL8: -251 A>T, IL1A: -889 C>T, IL1β: -31 T>C, фактор некроза опухоли (TNF): -308 G>A, TNFA: -238 G>A, IL4: -590 C>T, IL10: -592 A>C, IL4R: 1902 A>G (Gln576Arg).
Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с анализом кривых плавления модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes с помощью коммерческих тест-систем производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия. ДНК для генотипирования выделяли из образцов периферической и пуповинной крови взятой с ЭДТА в качестве антикоагулянта с помощью комплекта реагентов «Проба-ГС-генетика» производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия.
Статистическая обработка полученных результатов была проведена на персональном компьютере при помощи программного пакета SPSS Statistics 17.0 for Windows.
При построении бинарной логистической регрессионной модели, использовался пошаговый метод обратной селекции (обратный метод Вальда). Качество приближения регрессионных моделей при каждом последующем шаге оценивалось при помощи функции подобия – отрицательного удвоенного значения логарифма этой функции (-2LL). Оценка качества полученных моделей проводилась с помощью ROC-анализа.
Результаты исследования и их обсуждение
Возраст беременных колебался от 18 до 41 года и составил в среднем 31,4±0,5 и 28,4±0,5 года (по группам соответственно). Анализ массо-ростовых отношений отклонений от популяционных норм не выявил. Средняя масса тела составила 64,4±2,1 и 63,3±2,2 кг, средний рост 167,1±3,2 и 164,9±4,6 см (по группам соответственно).
При изучении состояния здоровья исследуемых беременных с анализом особенностей соматического и гинекологического анамнеза было выявлено, что среди заболеваний мочевыделительной системы в группе 1 отмечалось статистически значимое увеличение частоты хронического пиелонефрита (22,2%, OR=1,9 (1,1–3,3)) и цистита (20,3%, OR=1,8 (1,2–3,3)). Среди гинекологических заболеваний в группе 1 было отмечено статистически значимое увеличение цервицита (51,3%, OR=1,5 (1,2–2,4)) и бесплодия (13,3%, OR=1,5 (1,1–2,4)).
Был проведен анализ исходной инфекционно-воспалительной заболеваемости с определением спектра возможных возбудителей. В основной группе статистически значимо чаще встречались хроническая рецидивирующая герпетическая инфекция (24,1%, OR=2,5 (1,4–4,5)) и кандидозный вульвовагинит (23,4%, OR=1,8 (1,1–3,1)). Кроме этого, в группе 1 статистически значимо чаще в анамнезе отмечалась неразвивающаяся беременность (13,9%, OR=2,1 (1,1–4,4)).
Учитывая недостаточную предсказательную способность клинических факторов в реализации ВУИ, было проведено изучение ассоциации реализации последней с различными осложнениями беременности и неонатальными исходами. Течение настоящей беременности в I триместре у пациенток основной группы статистически значимо чаще осложнялось угрозой прерывания беременности (60,1%, OR=2,7 (1,8-2,1)), ретрохориальной гематомой по данным ультразвукового исследования (6,3%, OR=4,4 (1,2-16,4)).
При анализе инфекционно-воспалительной заболеваемости в I триместре у беременных основной группы статистически значимо чаще выявляли бактериальный вагиноз (17,1%, OR=1,9 (1,1–3,7)), хламидиоз (3,2%, OR= 1,4 (1,1–3,1)) и микоплазмоз (4,4%, OR= 2,1 (1,1–7,7)).
Во II триместре у пациенток группы 1 чаще отмечалось формирование истмико-цервикальной недостаточности, потребовавшей проведения хирургической коррекции (10,1%, OR=2,3 (1,0–5,6)), плацентарная недостаточность (18,4%, OR=11,0 (3,8–32,1)) и анемия (22,2%, OR=6,0 (2,8–13,0)).
Из особенностей течения III триместра беременности в группе 1 следует отметить преобладание анемии (25,9%, OR=3,1 (1,8–5,7)), маловодия (18,4%, OR=8,8 (2,0–39,9)), задержки роста плода (31,6%, OR=15,8 (10,9–19,0)), преэклампсии (10,1%, OR=2,7 (1,1–6,5)), а также преждевременного разрыва плодных оболочек (43,0%, OR=4,1 (1,1–14,4)).
Частота абдоминального родоразрешения путем операции кесарева сечения в основной группе практически в 2,5 раза превышала таковую в группе сравнения и составила 67,7% и 29,2% соответственно (OR=4,1 (2,6–12,2)).
При изучении исхода родов для плода установлено, что у детей группы 1 чаще диагностировалась асфиксия различной степени тяжести (34,6%, OR=1,8 (1,3–4,1)), неонатальная желтуха (37,9%, OR=2,2 (1,2–7,8)), задержка внутриутробного развития по гипотрофическому типу (26,6%, OR=1,7 (1,2–4,3)).
В настоящее время принято выделять такие факторы риска ВУИ, как отягощенный акушерско-гинекологический анамнез, патологическое течение беременности, заболевания мочеполовой системы и инфекционные заболевания любых других органов и систем у матери, возникающие во время беременности [2, 9, 10–13]. Однако C. Bose с соавт. [14] указывают на отсутствие корреляции между воспалительными заболеваниями матери и развитием ВУИ.
Так как во многих случаях на результативный признак влияет не один, а несколько факторов, а между факторами существуют сложные взаимосвязи, был выполнен многофакторный корреляционно-регрессионный анализ клинико-анамнестических характеристик. Следует отметить, что для повышения предсказательной способности помимо клинических факторов в анализ были включены осложнения течения беременности. Методом бинарной логистической регрессии была получена математическая модель, позволяющая предсказывать развитие ВУИ.
Вероятность (Р) ВУИ рассчитывается по формуле:
Р=1/(1±е-F) (1), где
F – классифицирующая функция.
С помощью обратного пошагового метода Вальда были получены 9 независимых предикторов, 2 из которых относились к I, 3 – ко II и 4 – к III триместру беременности. Уравнение классифицирующей функции:
F1=1,273×K1±0,945×K2±1,468×K3±0,906×K4±0,905×K5±0,613×K6±2,680×K7±0,796×K8‒1,052 (2), где
F1 – классифицирующая функция
K1 – I триместр: угрожающий выкидыш
K2 – I триместр: ранний токсикоз беременных
K3 – II триместр: кандидозный вульвовагинит
K4 – II триместр: задержка роста плода и/или плацентарная недостаточность
K5 – III триместр: маловодие
K6 – III триместр: угрожающие преждевременные роды
K7 – III триместр: задержка роста плода и/или плацентарная недостаточность
K8 – III триместр: преэклампсия
Проведенный ROC-анализ показал удовлетворительную предсказательную способность полученной модели: площадь под кривой составила 0,77. Критическим значением вероятности развития ВУИ, соответствующим максимальной суммарной чувствительности и специфичности, стала вероятность, равная 40%. В данной точке чувствительность модели составила 61%, специфичность – 84%.
В дальнейшем было проведено изучение распределения аллелей и генотипов однонуклеотидных полиморфизмов генов цитокинов. В результате однофакторного анализа установлено, что у матерей-носителей аллеля T в ‑31 позиции промоторной области гена IL1β достоверно чаще рождались дети с последующей реализацией ВУИ (согласно аутосомно-доминантной модели наследования OR=2,9 (1,4-6,0)). По данным литературы IL1β опосредует возникновение системного ответа [8, 15]. Он имеет схожие биологические эффекты с TNF-α, вызывая активацию лейкоцитов и эндотелиальных клеток, комплемента, синтез белков острой фазы. Уровень IL1β является одним из лучших прогностических критериев хориоамнионита [16].
Также исследование показало увеличение риска рождения ребенка с ВУИ у матерей с генотипом T/T полиморфизма IL8: -251 (согласно аутосомно-рецессивной модели наследования OR=1,6 (1,01-2,6)). Как известно, IL8 – мощный хемокин, участвующий в хемотаксисе нейтрофилов. Под действием IL8 происходит активация нейтрофилов и их миграция в очаг воспаления [6, 8]. Уникальность IL8 заключается в том, что, будучи одним из самых ранних провоспалительных медиаторов, этот цитокин долгое время остается в очаге воспаления [15].
Для матерей с генотипом G/G полиморфизма IL6: -174 C>G риск рождения ребенка с ВУИ также возрастал (согласно аутосомно-рецессивной модели наследования OR=1,7 (1,1-2,7)). IL6 является мультифункциональным цитокином, вовлеченным в воспаление, и продуцируется активированными моноцитами или макрофагами, эндотелиальными клетками, фибробластами, активированными T-клетками [16, 17], а также рядом клеток, не являющихся иммуноцитами.
Для оценки прогностической роли полиморфизма исследованных генов при развитии ВУИ была предпринята попытка построения комплексной математической модели, включающей наряду с клинико-анамнестическими характеристиками также данные о генотипировании пациенток.
Проведение регрессионного анализа с включением данных генотипирования пациенток позволило существенно упростить прогностическую модель: помимо двух генетических в уравнение вошло всего 3 клинических маркера, 2 из которых относятся к III триместру. Полученная прогностическая модель обладала сходными аналитическими характеристиками с предыдущей моделью: площадь под кривой составила 0,76. В области критического значения вероятности развития ВУИ, полученного на основании математической модели с использованием только клинических предикторов, чувствительность новой модели составила 60%, специфичность – 79%.
Уравнение классифицирующей функции:
F2=0,485×K1±0,365×K2±1,301×K3±0,820×K4‒3,474×K5‒2,695 (3), где
F2 – классифицирующая функция
K1 – генотип по локусу IL8: -251 A>T (1- A/A, 2 – A/T, 3 – T/T)
K2 – генотип по локусу IL1β: -31 T>C (1- С/С, 2 – С/Т, 3 – T/T)
K3 – II триместр: многоводие
K4 – III триместр: угрожающие преждевременные роды
K5 – III триместр: задержка роста плода и/или плацентарная недостаточность
Интересно отметить, что введение в математическую модель генетических предикторов привело к почти полному исключению ранних клинических маркеров, регистрируемых во II триместре. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования генотипирования для раннего выявления предрасположенности к внутриутробному инфицированию плода, тогда как поздние клинические маркеры, регистрируемые в III триместре, по-видимому, отражают реализацию этой предрасположенности. На практике это может быть использовано для выявления группы высокого риска развития ВУИ на самых ранних сроках беременности.
Независимыми генетическими маркерами, включенными в модель, явились генотипы IL1β и IL8 по функционально значимым полиморфным локусам, локализованным в промоторах соответствующих генов. Согласно литературным данным, аллель -31T гена IL1β и аллель -251T ассоциированы с высокой активностью гена и высоким базальным уровнем соответствующего цитокина [8, 15, 17]. При этом в нашем исследовании, как в результате однофакторного, так и многофакторного анализа выявлена ассоциация с ВУИ высокопродуктивных генотипов. В литературе имеются указания, что при наличии низкопродуктивного аллеля -251A гена IL8 концентрация IL8 в крови сильнее возрастает в ответ на стимуляцию липополисахаридов (ЛПС) [7, 8]. Аналогичная картина наблюдается и при замене IL6: -174G>C. Данный генетический маркер в нашем исследовании также продемонстрировал статистически значимую ассоциацию высокопродуктивного генотипа G/G с повышенным риском реализации ВУИ в ходе однофакторного анализа. Показана ассоциация -174G-аллеля с высоким базальным уровнем IL6 в плазме, но c низким интерлейкиновым ответом ex vivo в ответ на введение ЛПС [17].
Таким образом, имеется повышенный уровень готовности к развитию воспалительной реакции за счет повышенного базального уровня IL6, но в случае развития воспаления дополнительный прирост уровня IL6 низкий. Исходя из вышесказанного, логично предположить, что для эффективной профилактики внутриутробного инфицирования плода гораздо большее значение имеет не высокий базальный уровень провоспалительных цитокинов, а способность иммунной системы матери адекватно ответить активацией соответствующих звеньев врожденного иммунитета на внедрение инфекционных агентов.
Заключение
Таким образом, полученные данные демонстрируют возможность использования клинико-анамнестических и молекулярно-генетических данных в качестве предикторов ВУИ, своевременно выделяя группу беременных высокого риска ее реализации. Проведение молекулярно-генетического анализа может существенно дополнить арсенал диагностических методов для персонификации диагностического подхода и выработки дальнейшей тактики ведения данных пациенток.
